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酶免疫技術(shù)中酶和酶作用底物是怎么樣的呢?

2020-12-10 14:04 來源:醫(yī)學(xué)教育網(wǎng)
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備考很痛苦,等考試完回頭看的時(shí)候你會(huì)感覺很幸福!關(guān)于檢驗(yàn)職稱的考試,相信很多朋友都想知道“酶免疫技術(shù)”的相關(guān)知識(shí),為此醫(yī)學(xué)教育網(wǎng)小編為大家整理了“酶免疫技術(shù)中酶和酶作用底物”相關(guān)內(nèi)容,希望對(duì)大家有所幫助,祝大家考試順利,取得好成績!

酶和酶作用底物

(一)酶的要求: 

一個(gè)酶蛋白分子每分鐘可催化10 3 ~10 4 個(gè)底物分子轉(zhuǎn)變成有色產(chǎn)物。用于標(biāo)記的酶應(yīng)符合:

1.酶的活性要強(qiáng),催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高,純度高。

2.酶催化底物后產(chǎn)生的產(chǎn)物易于判斷或測量,方法簡單易行、敏感和重復(fù)性好。

3.作用專一性強(qiáng) ,酶活性不受樣品中其他成分的影響,受檢組織或體液中不存在與標(biāo)記酶相同的內(nèi)源性酶或抑制物。用于均相酶免疫測定的酶還要求當(dāng)抗體與酶標(biāo)抗原結(jié)合后,酶活性可出現(xiàn)抑制或激活。

4.易與抗體或抗原偶聯(lián) ,標(biāo)記后酶活性保持穩(wěn)定,且不影響 標(biāo)記抗原與抗體的免疫反應(yīng)性 。

5.酶、輔助因子及其底物對(duì)人體無害 ,酶的底物易于配制、保存,酶及其底物應(yīng)價(jià)廉易得。

(二)常用的酶

1.辣根過氧化物酶(HRP):

目前酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)中應(yīng)用最廣泛 的標(biāo)記用酶。

由無色的糖蛋白(主酶)和亞鐵血紅蛋白(輔基)結(jié)合而成的復(fù)合物。

輔基是酶活性基團(tuán) ,而主酶則與酶活性無關(guān) ,HRP的純度用RZ(HRP分別在403nm和275nm處的吸光度比值)表示,RZ值應(yīng)大于3.0 。

RZ值僅說明血紅素基團(tuán)在HRP中的含量 ,并非表示HRP制劑的真正純度,而且RZ值高的HRP并不意味著酶活性也高,RZ值與酶活性無關(guān) 。

酶活性以單位U表示: 即1分鐘將1μmol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量。酶變性后,RZ值不變但活性降低 ,因此使用酶制劑時(shí),酶活性單位比RZ值更為重要。

2.堿性磷酸酶(AP):

大腸桿菌來源 的AP分子量80kD,酶作用最適pH為8.0 ;小牛腸黏膜AP 分子量為100kD,最適pH為9.6 ;后一種AP的活性高 于前者。

3.β-半乳糖苷酶(β-Gal):

β-Gal來源于大腸桿菌。因人血中缺乏此酶,以其制備的酶標(biāo)志物在測定時(shí)不易受到內(nèi)源性酶的干擾 ,從而提高特異性,被用于均相酶免疫測定 。

(三)常用的底物

1.HRP的底物

(1)鄰苯二胺(OPD):

 是HRP最為敏感的色原底物之一。OPD在HRP的作用下顯橙黃色 ,加強(qiáng)酸 如硫酸或鹽酸終止反應(yīng)后呈棕黃色 ,最大吸收峰在492nm 波長。OPD應(yīng)用液穩(wěn)定性差,易變色,需新配制后在1小時(shí) 內(nèi)使用,顯色反應(yīng)過程需避光 ,而且具有致癌 性。

(2)四甲基聯(lián)苯胺(TMB):

 TMB經(jīng)HRP作用后變?yōu)樗{(lán)色,加入硫酸終止 反應(yīng)后變?yōu)辄S色 ,最大吸收峰波長450nm。TMB穩(wěn)定性好,成色無需避光 ,無致突變作用,是目前ELISA中應(yīng)用最廣泛的底物 。缺點(diǎn)是水溶性差 。

(3)其他:

5-氨基水楊酸(5-ASA)和2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)。

2.AP的底物

常用對(duì)-硝基苯磷酸酯(p-NPP) ,p-NPP經(jīng)AP作用后的產(chǎn)物為黃色 對(duì)硝基酚,最大吸收峰波長為405nm。

3.β-半乳糖苷酶(β-Gal)的底物

常用4-甲基傘酮基-R-D半乳糖苷(4-MUU),酶作用后,生成高強(qiáng)度熒光 物4-甲基傘形酮(4-MU),其敏度性較HRP 高30~50倍,但測量時(shí)需用熒光計(jì)。

以上內(nèi)容是由醫(yī)學(xué)教育網(wǎng)小編為大家編輯整理的“酶免疫技術(shù)中酶和酶作用底物”相關(guān)知識(shí),還請(qǐng)大家多多關(guān)注醫(yī)學(xué)教育網(wǎng),會(huì)有更多更好的關(guān)于各類醫(yī)學(xué)考試的信息等著大家。今日事今日畢,今日也要努把力!

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