怎么樣制備熒光抗體?
夫志當(dāng)存高遠(yuǎn),只要堅(jiān)持、努力,勝利就會(huì)屬于你!“熒光抗體”是檢驗(yàn)職稱考試需要掌握的知識(shí),那“熒光抗體”是什么呢?以下是醫(yī)學(xué)教育網(wǎng)小編為大家整理得“熒光抗體”相關(guān)知識(shí),希望有助于大家備考!祝大家考試順利,取得好成績!
(一)抗體要求
將熒光素與特異性抗體以化學(xué)共價(jià)鍵的方式結(jié)合而成。一般需經(jīng)純化提取IgG后再作標(biāo)記。
(二)熒光素要求
異硫氰酸熒光素最常用
要求:
①應(yīng)具有能與蛋白質(zhì)分子形成共價(jià)鍵的化學(xué)基團(tuán),與蛋白質(zhì)結(jié)合后不易解離,而未結(jié)合的色素及其降解產(chǎn)物易于清除;
②熒光效率高,與蛋白質(zhì)結(jié)合后,仍能保持較高的熒光效率;
③熒光色澤與背景組織的色澤對(duì)比鮮明;
④與蛋白質(zhì)結(jié)合后不影響蛋白質(zhì)原有的生化與免疫性質(zhì);
⑤標(biāo)記方法簡單、安全無毒;
⑥與蛋白質(zhì)的結(jié)合物穩(wěn)定,易于保存。
(三)抗體的熒光素標(biāo)記
1.攪拌法:
適用于標(biāo)記體積較大、蛋白含量較高的抗體溶液。優(yōu)點(diǎn)是標(biāo)記時(shí)間短、熒光素用量少。但易引起較強(qiáng)的非特異性熒光染色。
2.透析法:
適用于標(biāo)記樣品量少、蛋白含量低的抗體溶液。此法標(biāo)記比較均勻,非特異染色也較低。
(四)熒光素標(biāo)記抗體的純化
抗體標(biāo)記完成后,還應(yīng)對(duì)標(biāo)記抗體作進(jìn)一步純化,以去除未結(jié)合的游離的熒光素。
純化方法可采用透析法或?qū)游龇蛛x法。
(五)熒光抗體的鑒定
1.熒光素與蛋白質(zhì)的結(jié)合比率
熒光素與蛋白的過量結(jié)合是非特異熒光著色的來源之一,而未結(jié)合者有抑制特異性熒光抗體反應(yīng)的作用。
熒光素結(jié)合到蛋白上的量的重要指標(biāo)是熒光素與蛋白質(zhì)的結(jié)合比率(F/P)。比值越大,則抗體結(jié)合的熒光素越多,反之則結(jié)合越少。一般用于組織切片的熒光抗體,其F/P=1.5為宜,用于活細(xì)胞染色F/P=2.4為宜。
2.抗體效價(jià)
可以采用雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)測定,抗原含量為1g/L時(shí),抗體效價(jià)>1:16者較為理想。
3.抗體特異性
①吸收試驗(yàn):向熒光抗體中加入過量相應(yīng)抗原反應(yīng)后,再用于陽性標(biāo)本染色,應(yīng)不出現(xiàn)明顯熒光;
②抑制試驗(yàn):陽性標(biāo)本先與相應(yīng)未標(biāo)記抗體反應(yīng),洗滌后,再加熒光抗體染色,熒光強(qiáng)度應(yīng)受到明顯抑制。
(六)熒光抗體的保存
真空干燥后可長期保存。
防止抗體失活和防止熒光淬滅。
小量分裝,-20℃凍存可保存2~3年。
稀釋后的抗體不宜長時(shí)間保存,在4℃可保存1~3天。
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