免疫印跡法檢測(cè)原理
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免疫印跡法是在蛋白質(zhì)電泳分離和抗原抗體檢測(cè)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一項(xiàng)檢測(cè)蛋白質(zhì)的技術(shù),它將SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的高分辨力與抗原抗體反應(yīng)的高特異性相結(jié)合。
第一階段為SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)??乖鹊鞍讟悠方?jīng)SDS處理后帶負(fù)電荷,在聚丙烯酰胺凝膠中從陰極向陽極泳動(dòng),分子量越小,泳動(dòng)速度就越快。此階段分離效果肉眼不可見(只有在染色后才顯出電泳區(qū)帶)。
第二階段為電轉(zhuǎn)移。此階段分離的蛋白質(zhì)條帶肉眼仍不可見。
第三階段為酶免疫定位。將印有蛋白質(zhì)條帶的硝酸纖維素膜(相當(dāng)于包被了抗原的固相載體)依次與特異性抗體和酶標(biāo)第二抗體作用后,加入能形成不溶性顯色物的酶反應(yīng)底物,使區(qū)帶染色。常用的HRP底物為3,3-二氨基聯(lián)苯胺(呈棕色)和4-氯-1-萘酚(呈藍(lán)紫色)。陽性反應(yīng)的條帶清晰可辨。并可根據(jù)SDS-PAGE時(shí)加入的分子量標(biāo)準(zhǔn),確定各組分的分子量。
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