時(shí)間分辨熒光免疫測定（TRFIA），跟著小編來學(xué)習(xí)一下吧！

用鑭系元素標(biāo)記抗原或抗體，用時(shí)間分辨技術(shù)測量熒光，同時(shí)檢測波長和時(shí)間兩個(gè)參數(shù)進(jìn)行信號分辨。

（一）基本原理

1.時(shí)間分辨

正常組織在激發(fā)光照射下可以發(fā)出一定波長的熒光，但該熒光壽命較短（1～10ns），而鑭系元素螯合物的熒光壽命較長（10～1000μs）。故待短壽命背景熒光完全衰變后再測定鑭系元素離子螯合物的特異性熒光信號。

2.Stokes位移：激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的波長差，如果Stokes位移小，激發(fā)光譜和發(fā)射光譜常有重疊，相互干擾，影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。鑭系元素位移大。

3.發(fā)射光譜和激發(fā)光譜：鑭系元素發(fā)射光譜帶較窄，多在613nm±1Onm。利用濾光片只允許此波段的熒光通過，避免干擾。

4.熒光標(biāo)記物的相對比活性：比活性是指單位時(shí)間內(nèi)每個(gè)標(biāo)記分子可被探測到的信號量。

5.信號增強(qiáng)

Eu3＋標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物在弱堿性溶液中被激發(fā)后的熒光信號較弱，加入一種酸性增強(qiáng)液可使Eu3＋從復(fù)合物上完全解離下來，并與另一種螯合劑所螯合，以增強(qiáng)熒光信號。

（二）標(biāo)記物和標(biāo)記方法

1.標(biāo)記物：多用Eu3＋和Tb3＋為標(biāo)記物，其中Eu3＋最為常用。

2.標(biāo)記方法：鑭系元素離子不能直接與抗原或抗體結(jié)合，需應(yīng)用具有雙功能基團(tuán)的螯合劑，其一端與鑭系元素離子結(jié)合，另一端與抗原或抗體蛋白分子上的氨基結(jié)合。

（三）方法類型

1.雙抗夾心法：待檢抗原與固相抗體結(jié)合，再與Eu3+標(biāo)記抗體結(jié)合，在酸性環(huán)境下，復(fù)合物上的Eu3+解離下來，在340nm激發(fā)光照射下，形成熒光。

2.固相抗體競爭法：待檢抗原和Eu3＋標(biāo)記的抗原與固相抗體競爭結(jié)合，熒光強(qiáng)度與待檢抗原成反比。

3.固相抗原競爭法：待檢抗原和固相抗原競爭Eu3＋標(biāo)記抗體，熒光強(qiáng)度與待檢抗原含量成反比。

（四）方法評價(jià)

1.優(yōu)點(diǎn)：

靈敏度高；分析范圍寬；標(biāo)記結(jié)合物穩(wěn)定，有效使用期長；測量快速，易自動(dòng)化；無放射性污染。

2.缺點(diǎn)：

易受環(huán)境、試劑和容器中的鑭系元素離子的污染，使本底增高。

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