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流式細(xì)胞儀的工作原理

2012-07-10 14:27 來源:
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1.流動室和液流系統(tǒng):流動室由樣品管、鞘液管和噴嘴等組成,常用光學(xué)玻璃、石英等透明、穩(wěn)定的材料制作。設(shè)計和制作均很精細(xì),是液流系統(tǒng)的心臟。樣品管貯放樣品,單個細(xì)胞懸液在液流壓力作用下從樣品管射出;鞘液由鞘液管從四周流向噴孔,包圍在樣品外周后從噴嘴射出。為了保證液流是穩(wěn)液,一般限制液流速度<10m/s.由于鞘液的作用,被檢測細(xì)胞被限制在液流的軸線上。流動室上裝有壓電晶體,受到振蕩信號可發(fā)生振動醫(yī)`學(xué)教育網(wǎng)搜集整理。

2.激光源和光學(xué)系統(tǒng):經(jīng)特異熒光染色的細(xì)胞需要合適的光源照射激發(fā)才能發(fā)出熒光供收集檢測。常用的光源有弧光燈和激光;激光器又以氬離子激光器為普遍,也有配合氪離子激光器或染料激光器。光源的選擇主要根據(jù)被激發(fā)物質(zhì)的激發(fā)光譜而定。氬離子激光器的發(fā)射光譜中,綠光514nm和藍(lán)光488nm的譜線最強(qiáng),約占總光強(qiáng)的80%;氪離子激光器光譜多集中在可見光部分,以647nm較強(qiáng)。免疫學(xué)上使用的一些熒光染料激發(fā)光波長在550nm以上,可使用染料激光器。將有機(jī)染料做為激光器泵浦的一種成份,可使原激光器的光譜發(fā)生改變以適應(yīng)需要即構(gòu)成染料激光器。例如用氬離子激光器的綠光泵浦含有Rhodamine 6G水溶液的染料激光器,則可得到550~650nm連續(xù)可調(diào)的激光,尤在590nm處轉(zhuǎn)換效率最高,約可占到一半。為使細(xì)胞得到均勻照射,并提高分辨率,照射到細(xì)胞上的激光光斑直徑應(yīng)和細(xì)胞直徑相近。因此需將激光光束經(jīng)透鏡會聚。色散棱鏡用來選擇激光的波長,調(diào)整反射鏡的角度使調(diào)諧到所需要的波長λ,為了進(jìn)一步使檢測的發(fā)射熒光更強(qiáng),并提高熒光訊號的信噪比,在光路中還使用了多種濾片。帶阻或帶通濾片是有選擇性地使某一濾長區(qū)段的光線濾除或通過。例如使用525nm帶通濾片只允許FITC(異硫氰熒光素)發(fā)射的525nm綠光通過。長波通過二向色性反射鏡只允許某一波長以上的光線通過而將此波長以下的另一特定波長的光線反射。在免疫分析中常要同時探測兩種以上的波長的熒光信號,就采用二向色性反射鏡,或二向色性分光器,來有效地將各種熒光分開。

3.光電管和檢測系統(tǒng):經(jīng)熒光染色的細(xì)胞受合適的光激發(fā)后所產(chǎn)生的熒光是通過光電轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)變成電信號而進(jìn)行測量的。光電倍增管(PMT)最為常用。PMT的響應(yīng)時間短,僅為ns數(shù)量級;光譜響應(yīng)特性好,在200~900nm的光譜區(qū),光量子產(chǎn)額都比較高。光電倍增管的增益從103到108可連續(xù)調(diào)節(jié),因此對弱光測量十分有利。光電管運(yùn)行時特別要注意穩(wěn)定性問題,工作電壓要十分穩(wěn)定,工作電流及功率不能太大。一般功耗低于0.5W;最大陽極電流在幾個毫安。此外要注意對光電管進(jìn)行暗適應(yīng)處理,并注意良好的磁屏蔽。在使用中還要注意安裝位置不同的PMT,因為光譜響應(yīng)特性不同,不宜互換。也有用硅光電二極管的,它在強(qiáng)光下穩(wěn)定性比PMT好。

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