選擇性沉淀是采用各種沉淀劑或改變某些條件促使抗原成分沉淀,從而達到純化的目的。
1.核酸去除法 從微生物或細胞提取蛋白質(zhì)抗原時,其中常含有大量核酸成分。除去核酸可用提取沉淀劑,如氯化錳、硫酸魚精蛋白或鏈霉素等。核糖核酸降解法較為簡便,用DNA或RNA酶與提取液共同作用30~60min(4℃),即可有效地除去核酸成分醫(yī)|學教育網(wǎng)搜集整理。
2.鹽析沉淀法這是最古老而又經(jīng)典的蛋白質(zhì)純化分離動技術(shù)。由于方法簡便、有效、不損害抗原活性等優(yōu)點,至今仍被廣泛應用。
(1)抗原的粗篩:用不同飽和度的硫酸銨或硫酸鈉可將一個復雜的組織液吩成若干組分,也可收集某一飽和度的鹽析沉淀物作為進一步純化的粗篩物。最常用的鹽析劑是33%~50%飽和度的硫酸銨。
(2)提取丙種球蛋白:丙種球蛋白主要為IgG(95%以上)。將35%~40%飽和度的硫酸銨沉淀物經(jīng)去鹽后可直接用于某些試驗作為抗體試劑。此法簡單、穩(wěn)定、固收率高,已成為免疫化學試驗的常規(guī)方法。
(3)抗原的濃縮:在液體中含量較少的抗原,如尿中的游離輕鏈及離子交換層析洗脫液中的抗原,可通過加入硫酸銨,將其沉淀下來,以利進一步純化。
3.有機溶劑沉淀法 有機溶劑以降低溶液的介電常數(shù),從而增加蛋白質(zhì)分子上不同電荷的引力,導致溶解度降低。另外,有機溶劑與水作用,能破壞蛋白質(zhì)的水化膜,故蛋白質(zhì)在一定濃度的有機溶劑中被沉淀析出。使用的有機溶劑多為乙醇和丙酮。高濃度的有機溶劑易引起蛋白質(zhì)變性、失活、操作必須在低溫下進行。Cohn(1942)低溫酒精沉淀法可將血漿蛋白分為5個組分,IgG屬于Cohn-3組分。
4.水溶性非離子型聚合物沉淀法 常用的聚合物為聚乙二醇(PEG)及硫酸葡聚糖。水溶性聚合物沉淀蛋白質(zhì)的機制尚不清楚,大致有如下解釋:
(1)聚合物與蛋白質(zhì)形成共沉物;聚合物與蛋白質(zhì)之間發(fā)生水的重分配;
(2)聚合物與蛋白質(zhì)形成復合物。此法受許多因素影響,主要是pH、離子強度、蛋白質(zhì)濃度和PEG的分子量等。分子量為2000~6000的PEG皆適宜于做蛋白沉淀用。
如若使用得當,效果甚為滿意。一般認為,PEG濃度在3%~4%時沉淀免疫復合物,6%~7%可沉淀IgM,8%~12%可沉淀IgG,12%~15%可沉淀其他球蛋白,25%可沉淀白蛋白。最突出的應用是用3%~4%的PEG沉淀免疫復合物,未結(jié)合的抗原和抗體留在溶液中。按此原理設計了快速測定法和循環(huán)免疫復合物測定法。