親和層析是利用生物大分子的生物學(xué)特異性，即生物分子間所具有的專一性親和力而設(shè)計(jì)的層析技術(shù)。例如抗原和抗體、酶和酶抑制劑（或配體）、酶蛋白和輔酶、激素和受體等之間有一種特殊的親和力，在一定條件下，它們能緊密地結(jié)合成復(fù)合物。如果將復(fù)合物的一方固定在不溶性載體上，則可從溶液中專一地分離和提純另一方。與上述其他純化方法相比，親和層析能產(chǎn)生相當(dāng)高的純化作用。另外，此法的優(yōu)點(diǎn)是迅速，有時(shí)僅一步即可達(dá)到純化的目的醫(yī)|學(xué)教育網(wǎng)搜集整理。

1.親和層析支持物的選擇作為親和層析支持物須符合以下要求：

①非特異性吸附低；

②液體通過(guò)時(shí)流速要快；

③在各種pH和高濃度鹽溶液中穩(wěn)定；

④必須有合適的、豐富的化學(xué)基團(tuán)，能有效地與蛋白質(zhì)或其它化合物結(jié)合；

⑤必須帶有豐富的微孔，以增加結(jié)合容量。符合以上5個(gè)條件的支持物有瓊脂糖、聚丙烯酰胺和多孔玻璃球，其中常用的是瓊脂糖珠（Sepharose2B、4B、6B）。

2.配體的選擇 所謂配體系指具有親和性的雙方，作為免疫親和層析專指抗原與抗體。良好的配體必須具備以下3個(gè)條件。

（1）抗原或抗體必須單一特異性：抗原或抗體的純化效果決定于固相中配體的純度。

（2）抗原與抗體之間必須有強(qiáng)的親和力：這種親和力決定于抗原決定簇的性質(zhì)和數(shù)量。對(duì)抗體來(lái)說(shuō)還決定于抗體來(lái)源動(dòng)物的種類和免疫時(shí)間，如馬抗血清親和力較低，免疫血清親和力較高；免疫時(shí)間短的親和力低。但是，親和力太強(qiáng)也不利，因?yàn)榻怆x抗原抗體復(fù)合物所需要的條件就要強(qiáng)烈，從而可造成蛋白質(zhì)的變性。例如用低pH（1.5～2.5）或高鹽（如6mol/L鹽酸胍）可使部分抗原或抗體活性降低或喪失。

（3）配體必須有一個(gè)適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)基團(tuán)，這個(gè)基團(tuán)不參與配體和大分子的特異結(jié)合，但可用來(lái)連接支持物，而且這種連接不應(yīng)當(dāng)影響配體與大分子結(jié)合的親和性。

3.抗原或抗體與支持物的結(jié)合 將抗原或抗體結(jié)合到支持物上的方法目前有20多種，但可歸結(jié)為載體結(jié)合法、物理吸附法、交聯(lián)法和網(wǎng)絡(luò)法4類。

結(jié)合法的一般步驟是先活化支持物上的功能基團(tuán)，然后將抗原或抗體連接到這些活化的基團(tuán)上。用來(lái)發(fā)生交聯(lián)的化學(xué)反應(yīng)必須足夠溫和，不致使抗原或抗體遭到破壞。交聯(lián)后，要徹底清洗支持物，以除去剩下的未交聯(lián)的物質(zhì)。

最常用的支持物是Separose4B，將此支持物與溴化氰在pH11時(shí)進(jìn)行處理，則能使支持物活化。此時(shí)溴化氰與支持物上的羥式反應(yīng)形成氨基甲酸酯基團(tuán)。加入溴化氰的量取決于支持物的量。如果希望取代程度提高，則加入溴化氰的量也要提高。交聯(lián)時(shí)首先要注意加入抗原或抗體的濃度。通常在交聯(lián)反應(yīng)混合物中的交聯(lián)蛋白質(zhì)濃度應(yīng)是親和分離濃度的20～30倍。這樣，溴化氰濃度也必須提高到200mg/ml凝膠。若希望最終產(chǎn)物含量較少，所加入的溴化氰也應(yīng)減少。交聯(lián)時(shí)的pH也應(yīng)注意，pH9.5～10時(shí)，活化的瓊脂糖珠很不穩(wěn)定。降低pH，也就減少了能反應(yīng)的配體濃度，交聯(lián)量就會(huì)減少。

親和層析中常用小分子抗原或其它化合物與支持物交聯(lián)，由于載體空間的位阻而影響了與抗原或其它親和物的結(jié)合，產(chǎn)生了所謂的無(wú)效吸附。另外，Sepharose4B交聯(lián)時(shí)要求有一游離的氨基，如果該抗原有具氨基則難于交聯(lián)?；谶@兩個(gè)原因，通常在瓊脂糖與抗原之間接上不同長(zhǎng)度的“手臂”。必要時(shí)這些“手臂”末端可接上游離氨基，以與不帶氨基的配基偶聯(lián)。常用的帶“手臂”瓊脂糖有氨基瓊脂糖（二亞胺）、羧基瓊脂糖（琥珀酸酐）、溴乙酰瓊脂糖（0-溴乙酰-N－羧基琥珀酰胺）、重氮鹽衍生物瓊脂糖和疏基瓊脂糖等。這些帶“手臂”的瓊脂糖有商品供應(yīng)，使用極為方便。

4.親和層析條件的選擇

（1）支持物與抗原或抗體結(jié)合后，還可能有多余的活性基團(tuán)，為了封閉這些殘基團(tuán)，必須用無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)或三乙醇胺過(guò)一次柱，以封閉活性基團(tuán)。

（2）去掉未結(jié)合及結(jié)合不牢固的蛋白質(zhì)。先用0.2mol/LNaHCO2（含0.1mol/LNaC1，pH9.0）洗脫2～3個(gè)柱體積，再用解脫劑處理一次親和層析柱。

（3）解脫劑有多種。常用的有0.2mol/LpH2.8甘氨酸－HC1緩沖液、0.1mol/LpH2.4甘氨酸緩沖液、7mol/L脲、5mol/LNaI、3mol/L硫氰酸鉀（或鈉）、1mol/L乙酸、6mol/L鹽酸胍、0.2mol/LKC1等。作為抗原抗體解脫劑，最多用的是3mol/L硫氰酸鉀（或鈉）及0.1mol/LpH2.4甘氨酸緩沖液。