免疫熒顯微技術的基本原理是：使熒光抗體與標本切片中組織或細胞表面的抗原進行反應，洗滌除去游離的熒光抗體后，于熒光顯微鏡下觀察，在黑暗背景上可見明亮的特異熒光。

（一）標本的制作

熒光顯微技術主要靠觀察切片標本上熒光抗體的染色結果作為抗原的鑒定和定位。因此標本制作的好壞直接影響到檢測的結果。在制作標本過程中應力求保持抗原的完整性，并在染色、洗滌和封埋過程中不發(fā)生溶解和變性，也不擴散至臨近細胞或組織間隙中去。標本切片要求盡量薄些，以利抗原抗體接觸和鏡檢。標本中干擾抗原抗體反應的物質(zhì)要充分洗去，有傳染性的標本要注意安全。

常見的臨床標本主要有組織、細胞和細菌三大類。按不同標本可制作涂片、印片或切片。組織材料可制備成石蠟切片或冷凍切片。石蠟切片因操作煩瑣，結果不穩(wěn)定，非特異反應強等已少應用。組織標本也可制成印片，方法是用洗凈的玻片輕壓組織切面，使玻片粘上1～2層組織細胞。細胞或細菌可制成涂片，涂片應薄而均勻。涂片或印片制成后應迅速吹干、封裝。置－10℃保存或立即使用。

（二）熒光抗體染色

于已固定的標本上滴加經(jīng)適當稀釋的熒光抗體。置濕盒內(nèi)，在一定溫度下溫育一定時間，一般可用25～37℃30min，不耐熱抗原的檢測則以4℃過夜為宜。用PBS充分洗滌，干燥。

（三）熒光顯微鏡檢查

經(jīng)熒光抗體染色的標本，需要在熒光顯微鏡下觀察。最好在染色當天即作鏡檢，以防熒光消退，影響結果。

熒光顯微鏡檢查應在通風良好的暗室內(nèi)進行。首先要選擇好光源或濾光片。濾光片的正確選擇是獲得良好熒光觀察效果的重要條件。在光源前面的一組激發(fā)濾光片，其作用是提供合適的激發(fā)光。激發(fā)濾光片有兩種。MG為紫外光濾片，只允許波長275～400nm的紫外光通過，最大透光度在365nm；BG為藍紫外光濾片，只允許波長325～500nm的藍外光通過，最大透光度為410nm.靠近目鏡的一組阻擋濾光片（又稱吸收濾光片或抑制濾光片）的作用是濾除激發(fā)光，只允許熒光通過。透光范圍為410～650nm，代號有OG（橙黃色）和GG（淡綠黃色）兩種。醫(yī)|學教育網(wǎng)搜集整理觀察FITC標記物可選用激發(fā)濾光片BG12，配以吸收濾光片OG4或GG9。觀察RB200標記物時，可選用BG12與OG5配合。

（四）實驗的類型

1.直接法用特異熒光抗體直接滴加于標本上，使之與抗原發(fā)生特異性結合。本法操作簡便，特異性高，非特異熒光染色因素少；缺點是敏感度偏低，每檢查一種抗原需制備相應的特異熒光抗體。

2.間接法可用于檢測抗原和抗體，本法有兩種抗體相繼作用，第一抗體為針對抗原的特異抗體，第二抗體（熒光抗體）為針對第一抗體的抗抗體。本法靈敏度高，而且在不同抗原的檢測中只需應用一種熒光抗體。

3.補體結合法本法是間接法的第一步抗原抗體反應時加入補體（多用豚鼠補體），再用熒光標記的抗補體抗體進行示蹤。本法敏感度高，且只需一種抗體。但易出現(xiàn)非特異性染色，加之補體不穩(wěn)定，每次需采新鮮豚鼠血清，操作復雜。因此較少應用。

4.標記法本法用FITC及羅丹明分別標記不同的抗體，而對同一標本作熒光染色。在有兩種相應抗原存在時，可同時見到橙紅和黃綠兩種熒光色澤。