【關(guān)鍵詞】 巨細(xì)胞病毒感染；抗原；病毒；腎移植；鏈菌素生物素標(biāo)記法；Detection

　　【摘要】 目的建立一種新的快速診斷巨細(xì)胞病毒（CMV）感染的方法并初步用于腎移植受者。方法 采用抗CMV抗原的單克隆抗體，運(yùn)用免疫組化鏈菌素-生物素標(biāo)記法對(duì)外周血白細(xì)胞核中CMV抗原（即刻早期抗原和早期抗原）進(jìn)行染色，診斷CMV感染。結(jié)果共檢測(cè)腎移植受者72例，CMV活動(dòng)性感染率為47%（34/72），CMV病發(fā)病為18%（13/72）。CMV抗原陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在CMV活動(dòng)性感染者中平均為11.5/5萬(wàn)WBC，在CMV病者為20.5±17.8/5萬(wàn)WBC.同時(shí)檢測(cè)10名健康人，結(jié)果均為陰性。結(jié)論該法具有快速、簡(jiǎn)便、成本低等優(yōu)點(diǎn)，且能達(dá)到定量檢測(cè)的目的，可用于臨床對(duì)CMV感染的早期快速診斷。

　　巨細(xì)胞病毒（cytomegalovirus，CMV）感染在免疫功能正常的健康人極少出現(xiàn)臨床癥狀，而在免疫功能低下或缺失的患者可能會(huì)發(fā)展成有嚴(yán)重臨床癥狀的CMV?。ɑ蚍QCMV綜合征），威脅患者的生命。在腎移植受者中，由于免疫抑制劑的應(yīng)用，CMV感染較為常見(jiàn)，約占50%或以上，其中10%～30%可發(fā)展成CMV病［1］，導(dǎo)致移植腎功能喪失或患者死亡。因此，對(duì)CMV感染進(jìn)行早期、準(zhǔn)確的診斷具有極其重要的意義。我們采用免疫組化鏈菌素-生物素標(biāo)記（labeled streptavidin biotin，LSAB）法對(duì)外周血白細(xì)胞中CMV抗原進(jìn)行染色從而診斷CMV感染，并將該方法初步應(yīng)用于臨床，達(dá)到了早期、快速診斷的目的，現(xiàn)介紹如下。

　　對(duì)象與方法

　　一、研究對(duì)象

　　檢測(cè)1996年2月～1997年3月在本院接受腎移植的受者72例，其中男52例，女20例，年齡26～65歲，平均42.5歲。所有受者術(shù)后均用環(huán)孢素A＋強(qiáng)的松＋硫唑嘌呤（CSA＋pred＋Aza）三聯(lián)免疫抑制方案。

　　二、設(shè)備及試劑

　　普通光學(xué)顯微鏡；CMV單克隆抗體；LSAB試劑盒（購(gòu)自丹麥DAKO公司，批號(hào)為K9002）；Tris堿。

　　三、CMV抗原檢測(cè)（LSAB法）

　　1.標(biāo)本收集和處理：外周靜脈血3～5 ml，EDTA抗凝，離心5分鐘（500 r/min），吸取血漿層移入另一離心管。離心8～10分鐘（1000 r/min），棄去上清液，加0.83% HCl數(shù)滴，冰水中作用5分鐘，以溶解混雜的紅細(xì)胞。加大量Tris-鹽酸堿緩沖液（TBS）稀釋，離心5分鐘（600～800 r/min），棄去上清液，加適量TBS，普通光學(xué)顯微鏡下調(diào)整細(xì)胞濃度（含WBC1.0×10⁶/ml）。

　　2.細(xì)胞片制備：微量吸管吸取上述白細(xì)胞懸液50 μl（含WBC5萬(wàn)個(gè)），加玻片上，面積約2 cm×2 cm大小，干燥后用4℃丙酮固定10分鐘，每例標(biāo)本涂片2張。

　　3.CMV抗原染色：細(xì)胞片置0.3%H₂O₂中10分鐘（室溫），以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶反應(yīng)，TBS洗片。滴加1:20倍稀釋的正常豬血清阻斷劑，阻斷非特異性蛋白結(jié)合，37℃作用30分鐘，TBS洗片；滴加1:20倍用TBS稀釋的抗CMV即刻早期蛋白和早期蛋白的單克隆抗體（一抗），37℃孵育30分鐘，TBS洗片。加1:400倍稀釋的連接劑（二抗，為兔抗鼠IgG），37℃30分鐘，TBS洗片；加1:400倍稀釋的鏈菌素（streptavidin），37℃30分鐘，TBS洗片。滴加新配制的3，3二氨基聯(lián)苯胺（DAB）溶液（含TBS 5 ml+DAB5 mg+3% H₂O₂ 15 μl）顯色1～3分鐘或光學(xué)顯微鏡下控制顯色；蘇木素液淡染1～2分鐘，清水洗片。25倍物鏡觀察整張細(xì)胞片，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)。

　　4.對(duì)照設(shè)立：（1）陽(yáng)性對(duì)照：用已知CMV病患者的細(xì)胞片作陽(yáng)性對(duì)照。（2）陰性對(duì)照：用tBS緩沖液代替一抗或不加一抗作陰性對(duì)照。

　　結(jié)果

　　一、染色結(jié)果

　　CMV抗原陽(yáng)性細(xì)胞核呈黃色或棕黃，陰性細(xì)胞核呈藍(lán)色。陽(yáng)性結(jié)果以每張細(xì)胞片上（含5萬(wàn)WBC）陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)（抗原指數(shù)）表示。

　　二、病例檢測(cè)結(jié)果

　　72例中，抗原陽(yáng)性者共34例（47%），陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為2.0～64.0/5萬(wàn)WBC，平均11.5/5萬(wàn)WBC.其中10.0～30.0/5萬(wàn)WBC者16例（占47%），＞30.0/5萬(wàn)WBC者5例（占15%）。

　　34例抗原陽(yáng)性者中，有癥狀的CMV病者13例（38%），陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)5.0～64.0/5萬(wàn)WBC，平均20.5±17.8/5萬(wàn)WBC，其中10.0～30.0/5萬(wàn)WBC者7例，＞30.0/5萬(wàn)WBC者4例。

　　21例無(wú)癥狀抗原陽(yáng)性者，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為2.0～42.0/5萬(wàn)WBC，平均8.0±9.9/5萬(wàn)WBC.

　　應(yīng)用本法檢查10名血清學(xué)陰性的健康人，結(jié)果均為陰性。

　　討論

　　1.目前診斷CMV感染常用方法有抗體檢查、病毒培養(yǎng)、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、病毒核酸雜交等，但都存在不足，難以滿足臨床需要。如抗體檢查，由于用免疫抑制劑后，部分患者可無(wú)抗體反應(yīng)或反應(yīng)延遲而影響陽(yáng)性率；病毒培養(yǎng)法繁瑣，費(fèi)時(shí)長(zhǎng)（1周以上），并且易受細(xì)菌、霉菌等生長(zhǎng)所污染，目前已很少應(yīng)用；病毒核酸雜交技術(shù)難度較大且復(fù)雜，難以普及應(yīng)用；而PCR檢查也易受多因素影響，并且由于敏感度高可能檢測(cè)出隱性感染者或出現(xiàn)假陽(yáng)性。此外，上述方法均不能做到定量檢測(cè)?；谏鲜鲆蛩?，參照國(guó)外的實(shí)驗(yàn)［2］并作適當(dāng)?shù)母倪M(jìn)（用LSAB法代替ABC法），我們對(duì)外周血白細(xì)胞中CMV抗原進(jìn)行檢測(cè)（LSAB法），避免了上述方法的不足，對(duì)CMV感染能做出快速的診斷。

　　2.CMV感染細(xì)胞后可在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)即刻早期、早期和晚期蛋白（即病毒抗原）。即刻早期蛋白屬磷酸蛋白，分子量為65 000，通常在病毒感染細(xì)胞后3～4小時(shí)即開始合成，并在以后的病毒基因表達(dá)中起著重要的作用；早期蛋白在其后稍晚合成［3］。兩者均屬病毒復(fù)制調(diào)控蛋白，其存在提示病毒呈活動(dòng)狀態(tài)。CMV抗原測(cè)定即是利用針對(duì)即刻早期蛋白的單克隆抗體，運(yùn)用免疫組化染色的方法對(duì)感染細(xì)胞核進(jìn)行染色，可以直接反映外周血中有無(wú)活動(dòng)性CMV感染。而隱性感染者CMV潛伏無(wú)復(fù)制，故無(wú)病毒蛋白表達(dá)，抗原染色為陰性。本研究對(duì)10名健康人檢查結(jié)果均為陰性。CMV抗原最早在感染后數(shù)小時(shí)即可檢測(cè)出來(lái)，可用于早期診斷。

　　3.目前國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道的CMV抗原檢測(cè)通常采用ABC法或免疫熒光檢測(cè)法［2，4］。ABC免疫組化法的缺點(diǎn)是常難避免內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的非特異性染色而致假陽(yáng)性。我們采用LSAB免疫組化法的優(yōu)點(diǎn)是過(guò)氧化酶直接結(jié)合在鏈菌素分子上，形成鏈菌素過(guò)氧化酶復(fù)合物，比ABC法中的卵白素-生物素-過(guò)氧化酶復(fù)合物分子量小，在組織中具有更強(qiáng)的穿透力；其次是因?yàn)殒溇嘏c生物素的化學(xué)親和力比卵白素更強(qiáng)，能與第二抗體更迅速牢固地結(jié)合，因而敏感性大大增加，且染色前我們用H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，用正常豬血清阻斷劑阻斷了非特異性蛋白結(jié)合而使假陽(yáng)性率降低［5］。LSAB法的另一優(yōu)點(diǎn)是染色背景清晰，染色時(shí)間（僅5～6小時(shí)）較ABC法（約8～12小時(shí)）大大縮短。免疫熒光法的缺點(diǎn)是需要熒光顯微鏡、且易受雜質(zhì)污染而影響判斷。LSAB法無(wú)需熒光顯微鏡，普通顯微鏡即可。我們發(fā)現(xiàn)只要染色時(shí)間控制恰當(dāng)，均能得到滿意的效果，陰性細(xì)胞和陽(yáng)性細(xì)胞具有明顯區(qū)別，易于判斷。

　　4.免疫組化法抗原檢測(cè)還可以做到定量檢測(cè)，這對(duì)CMV感染的診斷和治療具有重要的指導(dǎo)意義。CMV抗原指數(shù)是反映體內(nèi)病毒數(shù)量（即病毒“負(fù)荷”）的較好指標(biāo)，CMV病的發(fā)生與轉(zhuǎn)歸和體內(nèi)病毒“負(fù)荷”有一定的相關(guān)性［6］?？乖笖?shù)高或升高迅速，常提示為CMV病，低抗原指數(shù)或抗原指數(shù)穩(wěn)定者多為無(wú)癥狀活動(dòng)性感染。本組CMV病者中平均抗原指數(shù)為20.5±17.8/5萬(wàn)WBC，而無(wú)癥狀者為8.0±9.9/5萬(wàn)WBC，兩組比較差異有顯著性。我們還發(fā)現(xiàn)，隨著CMV感染治療的好轉(zhuǎn)，抗原指數(shù)也逐漸下降，治療無(wú)效者抗原指數(shù)變化不大或增高。此時(shí)可能為藥物劑量不足或病毒耐藥。本組13例CMV病者經(jīng)治療8例痊愈，抗原指數(shù)均下降，其中6例轉(zhuǎn)陰；而5例死亡者中2例抗原指數(shù)居高不下，3例下降緩慢，經(jīng)調(diào)整藥物劑量或更換藥物后，3例抗原指數(shù)下降，后因其他并發(fā)癥死亡，2例無(wú)效。值得注意的是，CMV病不僅與病毒負(fù)荷相關(guān)，還受其他因素如機(jī)體免疫水平、一般狀況、及是否伴發(fā)其他感染或排斥等影響，因此，少數(shù)抗原指數(shù)高者可能并無(wú)臨床癥狀，而低抗原指數(shù)者也有可能出現(xiàn)明顯的發(fā)熱等臨床表現(xiàn)，如本組病例中有抗原指數(shù)為42.0/5萬(wàn)WBC時(shí)仍無(wú)臨床疾病表現(xiàn)者，而有的則抗原指數(shù)僅為5.0/5萬(wàn)WBC即有明顯癥狀。因此，僅靠CMV抗原指數(shù)診斷CMV病應(yīng)慎重。本組結(jié)果表明，抗原指數(shù)為10.0～30.0/5萬(wàn)WBC者對(duì)CMV病的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值僅為43.8%（7/16），＞30.0/5萬(wàn)WBC時(shí)陽(yáng)性預(yù)測(cè)值是4/5.72例中有CMV病者13例，抗原檢測(cè)均陽(yáng)性，該法診斷CMV病敏感性為100%（13/13）。

　　cMV抗原檢測(cè)方法需時(shí)較短，一般僅需5～6小時(shí)，無(wú)需昂貴設(shè)備，在普通實(shí)驗(yàn)室即可開展，且成本較低，不失為一種快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確而敏感性高的診斷CMV感染的方法，目前國(guó)內(nèi)尚未開展，值得推廣應(yīng)用。

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