熒光抗體在使用前應(yīng)加以鑒定。鑒定指標(biāo)記包括效價(jià)及熒光素與蛋白質(zhì)的結(jié)合比率??贵w效價(jià)可以用瓊脂雙擴(kuò)散法進(jìn)行滴定,效價(jià)大于1:16者較為理想。熒光素與蛋白質(zhì)結(jié)合比率(F/P)的測(cè)定和計(jì)算的基本方法是:將制備的熒光抗體稀釋至A2801≈1.0,分別測(cè)讀A280 (蛋白質(zhì)特異吸收峰)和標(biāo)記熒光素的特異吸收峰,按公式計(jì)算。
F/P值越高,說(shuō)明抗體分子上結(jié)合的熒光素越多,反之則越少。一般用于固定標(biāo)本的熒光抗體以F/P=1.5為宜,用于活細(xì)胞染色的以F/P=2.4為宜。
抗體工作濃度的確定方法類似ELISA間接法中酶標(biāo)抗體的滴定。將熒光抗體自1:4~1:256倍比稀釋,對(duì)切片標(biāo)本作熒光抗體染色。以能清晰顯示特異熒光、且非特異染色弱的最高稀釋度為熒光抗體工作濃度。
熒光抗體的保存應(yīng)注意防止抗體失活和防止熒光猝滅。最好小量分裝,-20℃凍存,這樣就可放置3~4年。在4℃中一般也可存放1~2年。
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