視網(wǎng)膜色素變性新療法，關(guān)注國(guó)際眼科的您一定不能錯(cuò)過(guò)，醫(yī)學(xué)教育網(wǎng)整理了相關(guān)內(nèi)容，希望對(duì)您有所幫助。

視網(wǎng)膜色素變性是一種具有明顯遺傳傾向的慢性、進(jìn)行性視網(wǎng)膜色素上皮和光感受器的變性疾病，發(fā)病率大約為四千分之一，會(huì)引發(fā)視網(wǎng)膜變性，并最終導(dǎo)致失明。這種遺傳性疾病已與超過(guò) 60 個(gè)基因（和超過(guò) 3，000 個(gè)突變）相關(guān)聯(lián)，因此為基因治療增加了難度。最近來(lái)自美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院眼科研究所的一組研究人員通過(guò)一種病毒載體直接向眼睛輸送了基于 CRISPR-as9 的治療元件，成功在視網(wǎng)膜變性小鼠中阻止了視網(wǎng)膜色素變性。

CRISPR-Cas9 基因組編輯技術(shù)給分子生物學(xué)領(lǐng)域帶來(lái)了一場(chǎng)變革。研究者們只需使用細(xì)菌核酸酶 Cas9 和引導(dǎo)酶切位點(diǎn)的短 RNA，就能夠在活體生物中有效敲除或者改變基因序列，這為許多疾病的治療帶來(lái)了新希望。

這一研究成果公布在 Nature Communications 雜志上，文章的通訊作者是眼科研究所的吳志堅(jiān)研究員（Zhijian Wu，音譯），第一作者為余文瀚（Wenhan Yu）博士，余文瀚博士指出，“AAV 載體是可以安全、高效地轉(zhuǎn)導(dǎo)光感受器細(xì)胞和其他一些視網(wǎng)膜細(xì)胞的成熟系統(tǒng)。它攜帶的基因能夠在光感受器細(xì)胞這種非分裂細(xì)胞中長(zhǎng)期存在表達(dá)。它解決了將 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)安全有效傳遞到體內(nèi)的問(wèn)題”。

在視網(wǎng)膜的眼后部組織中有兩種類型的細(xì)胞，能將光轉(zhuǎn)換成電信號(hào)發(fā)給大腦，視桿光感受器能在昏暗的光線下產(chǎn)生視覺(jué)，而視錐光感受器則能在光照條件下實(shí)現(xiàn)色彩視覺(jué)和觀察。遺傳突變主要影響前者，導(dǎo)致夜盲癥，就像是視網(wǎng)膜色素變性患者看到的那樣。不過(guò)由于視桿光感受器也會(huì)為視錐光感受器提供重要的結(jié)構(gòu)和營(yíng)養(yǎng)支持，因此視桿光感受器障礙或死亡會(huì)導(dǎo)致視錐光感受器變性和失明。

為此這項(xiàng)最新研究設(shè)計(jì)了一種 CRISPR 單導(dǎo)向 RNA（sgRNA），靶向視網(wǎng)膜轉(zhuǎn)錄因子：神經(jīng)視網(wǎng)膜亮氨酸拉鏈（Nrl），Nrl 能調(diào)控視網(wǎng)膜發(fā)育過(guò)程中特殊視桿細(xì)胞的命運(yùn)，并維持成熟視網(wǎng)膜內(nèi)的視桿細(xì)胞。研究小組將 Nrl-sgRNA 和 Cas9 內(nèi)切核酸酶通過(guò)兩個(gè)單獨(dú)的腺相關(guān)病毒（AAV）載體，直接遞送到小鼠視網(wǎng)膜上。他們指出，這種 AAV 載體的優(yōu)點(diǎn)就是能維持非分裂細(xì)胞（例如視網(wǎng)膜細(xì)胞）中長(zhǎng)期基因表達(dá)的能力。

研究人員利用基于 Cre 的重組系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)敲除 Nrl 可以將視桿細(xì)胞部分轉(zhuǎn)換類似視錐細(xì)胞，防止視桿細(xì)胞的死亡以及視網(wǎng)膜色素變性中二級(jí)視錐細(xì)胞的死亡。

余文瀚博士解釋道，“我們對(duì)接近成熟（2周）的小鼠注射 AAV-CRISPR，加上 AAV 系統(tǒng)攜帶的基因表達(dá)需要一定時(shí)間，我們判斷實(shí)際上 Cas9 蛋白表達(dá)達(dá)到峰值，系統(tǒng)真正起效的時(shí)候小鼠已經(jīng)至少 4 周大了。這時(shí)光感受器細(xì)胞已經(jīng)完全發(fā)育完成，所以視桿細(xì)胞很難再完全轉(zhuǎn)變成視錐細(xì)胞。華盛頓大學(xué) Corbo 組之前的 PNAS 文章也顯示，隨著視桿細(xì)胞的發(fā)育，一些視桿細(xì)胞特異性基因，像 Rhodopsin，其啟動(dòng)子被特定修飾，在修飾以后，敲除 Nrl 基因基本對(duì)其表達(dá)沒(méi)有影響。

事實(shí)上，我們并不希望將視桿細(xì)胞真正轉(zhuǎn)變成視錐細(xì)胞（一般是轉(zhuǎn)變成 s-cone）。這種轉(zhuǎn)變?cè)谂R床上叫做“Enhanced S Cone Syndrome”，一般就與 NRL 基因突變有關(guān)系。我們沒(méi)有完全轉(zhuǎn)變恰恰提示如果我們的方法轉(zhuǎn)化到臨床以后，可能并不會(huì)導(dǎo)致與 NRL 基因突變相關(guān)疾病相同的病變。“

由于 Cre 重組方法并不適用于人體，因此研究人員轉(zhuǎn)向了 CRISPR 系統(tǒng)。“這項(xiàng)新工作獲得了兩個(gè)方面的進(jìn)步：作者采用了了一種 AAV 介導(dǎo)的 CRISPR-Cas9 遞送系統(tǒng)，可以應(yīng)用于人類患者，并且他們指出了這種策略可以在多種視網(wǎng)膜變性模型中起作用。”

研究組首先將實(shí)驗(yàn)治療載體注射到 2 周齡野生型小鼠的視網(wǎng)膜中，然后觀察小鼠在三至四個(gè)月內(nèi)的變化。與注射對(duì)照載體的小鼠相比，接受治療的小鼠 Nr1 表達(dá)量降低。在注射后第 6 周，治療小鼠視桿細(xì)胞出現(xiàn)了下調(diào)的視桿細(xì)胞基因，以及上調(diào)的視錐細(xì)胞基因。同時(shí)研究人員也指出，這種治療不會(huì)對(duì)視錐細(xì)胞產(chǎn)生任何有害作用。

接下來(lái)，研究組在三種不同的視網(wǎng)膜色素變性小鼠模型上檢測(cè)了載體，其中包括視紫紅質(zhì)基因中表達(dá)顯性人類突變的模型，之后再觀察幾個(gè)月后小鼠的變化，結(jié)果表明在所有三種情況下，治療小鼠保留了更多的視桿細(xì)胞，阻止了視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞的死亡。

去年年初，美國(guó) Cedars-Sinai 醫(yī)學(xué)中心的研究人員利用 CRISPR-Cas9 刪除視網(wǎng)膜色素變性的遺傳突變，但是最新這項(xiàng)成果“有兩方面重要的區(qū)別：1）以前的研究一般針對(duì)單一基因突變，我們的策略理論上可以針對(duì)絕大部分視桿細(xì)胞相關(guān)基因突變引起的視網(wǎng)膜色素變性；2）以前的研究一般是在新生小鼠眼內(nèi)注射質(zhì)粒，通過(guò) electroporation 傳遞基因，此時(shí)視網(wǎng)膜還未停止發(fā)育，一些細(xì)胞還會(huì)分裂分化；而我們的方法是用 AAV 傳遞 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)，對(duì)接近成熟（2周）或成熟（4-5周）小鼠進(jìn)行治療，主要針對(duì)非分裂細(xì)胞”，余文瀚博士說(shuō)。

而且這一策略理論上可以針對(duì)大多數(shù)基因相關(guān)的 RP，“但是我們的 AAV-CRISPR 系統(tǒng)確實(shí)也可以靶向其他的基因。目前更容易達(dá)到的策略是敲除顯性致病基因，類似的研究已經(jīng)有報(bào)道。當(dāng)然，未來(lái)隨著技術(shù)的發(fā)展，我們希望能夠有一天實(shí)現(xiàn)基因修復(fù)。”

不過(guò)在人體進(jìn)行檢測(cè)之前，還需要回答幾個(gè)問(wèn)題，比如 Cas9 的長(zhǎng)期表達(dá)是否對(duì)視網(wǎng)膜有害，以及 Nrl 的消除在人體中是否能有小鼠中相同的效果。

佛羅里達(dá)大學(xué)的 Shannon Boye 評(píng)論道，“還需要更多的研究來(lái)確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但這些研究對(duì)于分析 CRISPR-Cas9 在有絲分裂后神經(jīng)元中的作用方面令人鼓舞。”

余文瀚博士說(shuō)，“我們只是走了一小步，證明了這個(gè)策略的可行性和有效性。我們認(rèn)為要真正實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用，主要要解決安全性問(wèn)題，首先要解決CRISPR的安全性，主要是 off-target 效應(yīng)。我們的研究在 10 個(gè)可能的 off-target 位點(diǎn)并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)突變，但不能排除其他位點(diǎn)可能發(fā)生了突變；醫(yī)學(xué)教育|網(wǎng)搜集整理也有人認(rèn)為在體內(nèi)由于種種原因不容易產(chǎn)生或積存 off-target 事件，但因?yàn)?Cas9 的持續(xù)表達(dá)，隨著時(shí)間推移這種可能性理論上會(huì)越來(lái)越大。我們期待隨著更特異、可控的 CRISPR 系統(tǒng)的出現(xiàn)，這個(gè)問(wèn)題可以得到解決。其次是策略本身的安全性，也就是我前面提到的NRL基因突變相關(guān)疾病的問(wèn)題，雖然我們的結(jié)果表明在視桿細(xì)胞發(fā)育完成以后敲除 Nrl 不會(huì)將視桿細(xì)胞完全轉(zhuǎn)化成視錐細(xì)胞，提示可能并不會(huì)引起相關(guān)的病變，但這個(gè)策略本身的安全性還需要在跟人類進(jìn)化關(guān)系更近的靈長(zhǎng)類動(dòng)物上進(jìn)行驗(yàn)證。”

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