【關(guān)鍵詞】  糖尿病性白內(nèi)障；阿司匹林；糖基化；氧化損傷

　　Preventive effect of aspirin eyedrops against diabetic cataract

　　GUO Yong， YAN Hong， DING ZhengHua， HA WenJing

　　Department of Ophthalmology， Tangdu Hospital， Fourth Military Medical University，  Xian  710038，  China

　　【Abstract】AIM： To investigate the role and mechanism of aspirin （Asp） eyedrops in preventing diabetic cataract. METHODS： Diabetic cataract was induced by streptozocin （STZ）。 The diabetic rats （blood glucose>14 mmol/L） were   randomly divided into 3 groups： lower concentration aspirin treatment group （0.5 g/L）， higher concentration aspirin treatment group （1 g/L） and untreated group . The former two groups received Asp eyedrops to the left eye， twice daily. Progression of lens opacification was recorded using slit lamp at regular time intervals. The levels of advanced glycation end products （AGE）， glutathione reductase （GR）， catalase （CAT）， and glutathione （GSH） were determined spectrometically. RESULTS： Asp treatment delayed the progression of cataracts in diabetic rats and the delay was statistically significant from the 6th to the 9th week of diabetes （about 0.5-1 grade， P<0.05 vs untreated diabetic rats）。 An increase in CAT（about 260%） and GSH（about 20%）was found in the lens of Asp treated diabetic rats （P<0.05 vs untreated diabetic rats）。 The level of glycated lens protein in the untreated diabetic rats was significant higher as compared with that in Asp treated diabetic rats （28%， P<0.05）。  CONCLUSION： Asp can delay the progression of lens opacification only during the earlier stages. The delay may associate with the protective effect of Asp against inactivation of antioxidation enzymes and the formation of AGEs.

　　【Keywords】 diabetic cataract； aspirin； glycosylation； oxidative damage

　　【摘要】 目的：探討阿司匹林滴眼液抑制糖尿病性白內(nèi)障的作用效果及作用機(jī)制。 方法： 復(fù)制鏈脲佐菌素（streptozocin， STZ）糖尿病大鼠模型，成模后（血糖>14 mmol/L）將動(dòng)物分為低濃度阿司匹林治療組（0.5 g/L）、高濃度阿司匹林治療組（1 g/L）和未治療組。 治療組每日給予2次阿司匹林滴眼液治療左眼，采用裂隙顯微鏡觀察并記錄晶狀體混濁的程度，使用分光光度計(jì)測(cè)定晶狀體中谷胱甘肽、糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end product， AGE）的含量以及谷胱甘肽還原酶、過氧化氫酶的活性。 結(jié)果： 建立糖尿病大鼠模型后6至9 wk，與糖尿病大鼠相比，治療組大鼠晶狀體混濁程度降低0.5~1個(gè)級(jí)別，谷胱甘肽的含量升高20％，過氧化氫酶的活性增強(qiáng)260％，而AGE的含量降低28％，它們之間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論： 阿司匹林可能通過抑制晶狀體蛋白質(zhì)糖基化和氧化損傷的綜合作用，延緩早期的糖尿病大鼠晶狀體混濁。

　　【關(guān)鍵詞】 糖尿病性白內(nèi)障； 阿司匹林； 糖基化； 氧化損傷

　　0引言

　　糖尿病性白內(nèi)障已成為嚴(yán)重危害人群生活質(zhì)量的疾患。 隨著對(duì)糖尿病性白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制逐步深入的研究，藥物治療糖尿病性白內(nèi)障越來越多的受到人們的關(guān)注。 研究表明晶狀體蛋白質(zhì)糖基化反應(yīng)是糖尿病性白內(nèi)障重要發(fā)病機(jī)制之一［1］。 晶狀體蛋白質(zhì)糖基化引起的構(gòu)象改變［2］，以及蛋白質(zhì)巰基暴露帶來的氧化損傷［3］，均能增加晶狀體蛋白質(zhì)交聯(lián)和積聚，最終導(dǎo)致白內(nèi)障的形成。 而阿司匹林是優(yōu)秀的抗糖基化、抗氧化劑［4］。 本研究對(duì)使用阿司匹林滴眼液治療的糖尿病大鼠進(jìn)行了系統(tǒng)的監(jiān)測(cè)，對(duì)它的晶狀體進(jìn)行了綜合的生化分析。

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　實(shí)驗(yàn)使用50只SD雄性大鼠（由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），體質(zhì)量90~160 g. 適應(yīng)性喂養(yǎng)大鼠5  d后，尿糖試紙檢測(cè)大鼠尿糖均呈陰性。 BQ900裂隙燈檢查大鼠晶狀體及角膜未見異常。 隨機(jī)抽取5只為正常對(duì)照組（A組），其余大鼠腹腔注射10 g/L STZ（鏈脲佐菌素，Sigma公司）枸櫞酸溶液， STZ枸櫞酸溶液0.22 μm微孔過濾器過濾后，以65 mg/kg的注射量進(jìn)行大鼠腹腔注射，同時(shí)向正常組大鼠腹腔注射同量的枸櫞酸溶液［5］。 72 h后，取鼠尾血測(cè)血糖（樂康全2血糖檢測(cè)儀 羅氏公司）。 13只大鼠血糖＜14 mmol/L被剔除［6］。 32只大鼠血糖＞14 mmol/L納入實(shí)驗(yàn)。

　　5只正常大鼠為對(duì)照組（A組），32只糖尿病大鼠隨機(jī)分為低濃度治療組9只（B組）、高濃度治療組9只（C組），未治療組14只（D組）。 配制0.025 mol/L pH 7.4的磷酸鈉緩沖液，阿司匹林分別以0.5 g/L和1 g/L的濃度溶于磷酸鈉緩沖液。 給予B組大鼠雙眼滴0.5 g/L阿司匹林磷酸鈉溶液，C組大鼠雙眼點(diǎn)1 g/L阿司匹林磷酸鈉溶液，D組大鼠雙眼只點(diǎn)磷酸鈉緩沖液，均為每日兩次。

　　1.2方法

　　1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血糖的監(jiān)測(cè)每月從大鼠尾端針刺取血，滴于血糖試紙上準(zhǔn)確反應(yīng)5 s，使用羅氏血糖儀（愛康全）比色并記錄。

　　1.2.2晶狀體混濁程度的監(jiān)測(cè)使用BQ900裂隙燈觀察大鼠，使用裂隙燈自帶數(shù)碼相機(jī)照相。 每周根據(jù)晶體混濁情況分級(jí)。 分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參考牛津大學(xué)眼科實(shí)驗(yàn)室晶狀體分級(jí)方法［7］。 每周觀察一次并記錄。

　　1.2.3分離大鼠晶狀體STZ注射13 wk后，脫頸法處死所有大鼠，摘除大鼠雙眼，分離晶狀體，稱重標(biāo)記，分類保存于-70°冰箱。

　　1.2.4晶狀體糖基化終末產(chǎn)物的測(cè)定［8］取備用沉淀參照Blakytny 的方法，繪制不同濃度5氫甲基康醛的標(biāo)準(zhǔn)曲線，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出標(biāo)本中糖基化終末產(chǎn)物的含量。

　　1.2.5晶狀體內(nèi)谷胱甘肽及酶類的測(cè)定谷胱甘肽還原酶、過氧化氫酶的活性以及谷胱甘肽的含量都是通過南京建成化學(xué)試劑公司試劑盒測(cè)定。 組織蛋白濃度通過考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定。

　　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法： 所有數(shù)據(jù)在Windows環(huán)境下經(jīng)Spss11.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理。 重復(fù)測(cè)量資料的方差分析、完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的OneWay ANOVA分析，顯著性水平為α=0.05.

　　2結(jié)果

　　2.1血糖STZ注射前，所有大鼠血糖均正常。 STZ注射72 h后32只大鼠血糖大于14 mmol/L，占總數(shù)的58％（32/55），它們與注射前相比血糖明顯升高（P<0.05）。 STZ注射8  wk后B組大鼠中1只大鼠血糖降至14 mmol/L以下，占總數(shù)的3.1％（1/32），各時(shí)間段血糖檢測(cè)發(fā)現(xiàn)B，C，D組間血糖差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 正常組大鼠血糖一直處于低水平，明顯低于B，C，D組大鼠（P<0.05，表 1）。

　　2.2晶狀體混濁的程度在實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)晶狀體混濁程度分級(jí)并記錄。 實(shí)驗(yàn)過程中，A組大鼠晶狀體一直保持透明，而B組、C組與D組大鼠均于STZ注射4 wk后開始出現(xiàn)晶狀體混濁，6 wk后混濁程度顯著加劇，至10 wk后出現(xiàn)乳白色混濁。 在STZ注射后6至9 wk，B，C組大鼠晶狀體混濁程度低于D組大鼠，其差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，圖1）。

　　表1血糖的變化（略）

　　aP<0.05 vs  A.

　　A：正常組； B：低濃度阿司匹林治療組；C：高濃度阿司匹林治療組；D：糖尿病組。

　　動(dòng)物在點(diǎn)藥前后無明顯結(jié)膜充血，角膜損傷等刺激癥狀。

　　圖1阿司匹林滴眼液對(duì)大鼠晶狀體混濁程度的影響（略）

　　而對(duì)B， C組與D組中血糖過高（血糖>20 mmol/L）的大鼠進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)晶狀體混濁程度的差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 對(duì)B， C與D組中血糖微高的大鼠（14~20 mmol/L）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)第5至11 wk B，C組大鼠晶狀體混濁程度均明顯低于D組大鼠， 其差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，圖2）。

　　圖2阿司匹林滴眼液對(duì)血糖微高（14~20 mmol/L）的大鼠晶狀體混濁程度的影響（略）

　　2.3晶狀體中糖基化終末產(chǎn)物、谷胱甘肽及酶類測(cè)定STZ注射13 wk后，所有糖尿病大鼠晶狀體均進(jìn)展到7級(jí)，對(duì)晶狀體離體分析發(fā)現(xiàn)D組晶狀體中谷胱甘肽的含量及谷胱甘肽還原酶、過氧化氫酶的活性均明顯低于A組（P<0.05），并且D組晶狀體中過氧化氫酶的活性及谷胱甘肽的含量明顯低于B，C組（P<0.05），糖基化終末產(chǎn)物含量明顯高于其他組（P<0.05）。 而及谷胱甘肽還原酶的活性B，C，D組間差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 水溶性晶狀體蛋白各組間差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，表 2）。

　　表2在STZ注射后13 wk時(shí)，晶狀體中蛋白及酶的測(cè)定（略）

　　aP<0.05  vs  A， cP<0.05 vs D.  A：正常組； B：低濃度阿司匹林治療組；C：高濃度阿司匹林治療組；D：糖尿病組。

　　3討論

　　在實(shí)驗(yàn)中，我們采用阿司匹林滴眼液的給藥方式，避免了重復(fù)腹腔注射引起的多發(fā)感染等全身副反應(yīng)，也簡(jiǎn)化了操作。 阿司匹林滴眼液pH值控制在7.25～7.45之間，Perlovich曾報(bào)道阿司匹林溶液不穩(wěn)定，容易分解［9］。 為了防止阿司匹林滴眼液失效，我們每次新鮮配置阿司匹林滴眼液，局部應(yīng)用后大鼠未出現(xiàn)結(jié)膜充血等異常表現(xiàn)。 所以局部應(yīng)用阿司匹林滴眼液是安全和簡(jiǎn)便的，滴眼液比腹腔注射更適用于眼科臨床，在篩選其他防治糖尿病性白內(nèi)障藥物研究中，滴眼液是良好的給藥途徑。

　　在阿司匹林滴眼液治療的同時(shí)，我們對(duì)大鼠晶狀體進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)在糖尿病早期（6~9 wk）阿司匹林可以降低晶狀體的混濁程度，而大鼠晶狀體的離體培養(yǎng)也證明了阿司匹林延緩晶狀體混濁的作用［10］，但是到了后期（9~13 wk）阿司匹林不能降低晶狀體的混濁程度。 我們把糖尿病大鼠分為血糖過高大鼠和血糖微高大鼠，發(fā)現(xiàn)對(duì)于血糖過高大鼠阿司匹林沒有延緩晶狀體混濁的效果，而對(duì)于血糖微高的大鼠，阿司匹林明顯的延緩了晶狀體混濁（5~11 wk）。 而且與高濃度阿司匹林相比，低濃度阿司匹林具有更強(qiáng)延緩晶狀體混濁的趨勢(shì)，這可能與阿司匹林濃度過高所導(dǎo)致的晶狀體損傷有關(guān)［11］。

　　雖然實(shí)驗(yàn)證明阿司匹林具有降低糖尿病大鼠晶狀體混濁程度的作用，但其作用機(jī)制尚不十分明確。 目前認(rèn)為，糖尿病性白內(nèi)障是多種因素綜合作用的結(jié)果，其中最主要的原因是：晶狀體蛋白質(zhì)發(fā)生的糖基化反應(yīng)和氧化損傷 ［12］。

　　在實(shí)驗(yàn)中，我們對(duì)未使用阿司匹林治療的糖尿病大鼠晶狀體中AGE的含量進(jìn)行測(cè)量，發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠晶狀體AGE的含量明顯高于正常大鼠（P<0.05）。 這說明大鼠血糖的升高促進(jìn)了AGE的形成［13］。 同時(shí)，我們測(cè)定并對(duì)比阿司匹林治療組和糖尿病組大鼠中AGE的含量，發(fā)現(xiàn)阿司匹林不但抑制了AGE的形成，而且可以使AGE的含量降至正常水平以下。 Blakynty和Harding［14］認(rèn)為阿司匹林分子中的乙?；梢酝铙w蛋白質(zhì)中的游離NH2基團(tuán)或者賴氨酸、精氨酸的εNH2基團(tuán)發(fā)生乙?；磻?yīng)，使晶狀體蛋白質(zhì)的活躍NH2基團(tuán)被封閉，阻止了還原糖醛基與自由氨基發(fā)生的非酶糖基化反應(yīng)（Maillard反應(yīng)），這可能是阿司匹林具有抗糖基化作用的原因。

　　還原型谷胱甘肽和過氧化氫酶均是晶狀體內(nèi)抗氧化的關(guān)鍵物質(zhì)，我們對(duì)大鼠晶狀體中過氧化氫酶的活性和還原型谷胱甘肽的含量進(jìn)行測(cè)量后，發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠晶狀體中谷胱甘肽的含量以及過氧化氫酶的活性均明顯下降。 而谷胱甘肽、過氧化氫酶的減少必然會(huì)增加晶狀體受到氧化劑攻擊的機(jī)會(huì)，致使晶狀體蛋白質(zhì)發(fā)生氧化損傷，最終發(fā)生晶狀體混濁［15］。 對(duì)比阿司匹林治療組和糖尿病組大鼠中的谷胱甘肽、過氧化氫酶，發(fā)現(xiàn)阿司匹林可以維持晶狀體正常的氧化還原狀態(tài)，甚至逆轉(zhuǎn)了抗氧化酶類活性的降低。 這是因?yàn)椋喊⑺酒チ终T導(dǎo)的乙?；磻?yīng)可以使晶狀體蛋白質(zhì)中的自由氨基免受氧化自由基的攻擊［16］。

　　綜上所述，本研究表明阿司匹林滴眼液配制簡(jiǎn)便而且安全可靠。 在糖尿病早期阿司匹林滴眼液明顯的延緩了血糖微高大鼠的晶狀體混濁，而這種作用與阿司匹林抑制非酶糖基化反應(yīng)及蛋白質(zhì)氧化損傷有關(guān)。 因此本研究為藥物治療白內(nèi)障提供可靠的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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