遺傳性疾病已經(jīng)成為威脅人類健康的主要疾病之一。在沒有找到一種有效的治療方法之前，用產(chǎn)前診斷技術(shù)預(yù)防遺傳病患兒的出生，是達(dá)到減少乃至杜絕遺傳病發(fā)生的主要途徑。本世紀(jì)60年代以來，羊膜腔穿刺技術(shù)、絨毛膜取樣技術(shù)已經(jīng)常規(guī)地應(yīng)用于圍產(chǎn)兒監(jiān)測，有效地減少了遺傳病患兒的出生，同時產(chǎn)前診斷技術(shù)本身也得到了不斷的發(fā)展，主要表現(xiàn)在兩個方面：無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷及植入前遺傳學(xué)診斷（preimplantationgeneticdiagnosis，PGD）。PGD指對配子或移入到子宮腔之前的胚胎進(jìn)行遺傳學(xué)分析，去除有遺傳缺陷的配子或胚胎。它可以有效地避免傳統(tǒng)的產(chǎn)前診斷技術(shù)對異常胚胎進(jìn)行治療性流產(chǎn)的要求，因而受到廣泛關(guān)注。1989年，英國Handyside成功地用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)分析卵裂球的性別構(gòu)成，完成了世界上第一例PGD診斷，開創(chuàng)了產(chǎn)前診斷的新紀(jì)元。進(jìn)入90年代，植入前診斷技術(shù)有了飛速發(fā)展。1994年，Moe用熒光原位雜交（fluorescentinsituhybridization，F(xiàn)ISH）技術(shù)，在植入前診斷染色體非整倍體及胚胎性別獲得成功。此后，多重PCR，熒光PCR，多色FISH等技術(shù)，特別是1999年以來開展的間期核轉(zhuǎn)換（interphasenuclerconversion）技術(shù)，全基因組擴(kuò)增（wholegenomeamplification，WGA），比較基因組雜交（comparativegenomichybridization，CGH）技術(shù)相繼用于PGD，進(jìn)一步促進(jìn)了該技術(shù)的研究和應(yīng)用。目前在全世界范圍內(nèi)，包括我國在內(nèi)，已有18個國家，50多個PGD中心在從事相應(yīng)的研究，已經(jīng)分娩的100多例新生兒發(fā)育良好，初步證實(shí)PGD是一種安全、可靠的產(chǎn)前診斷技術(shù)。

　　一、PGD的研究進(jìn)展

　　1.取材途徑：PGD是指在胚胎移入到宮腔之前的診斷。其獲取診斷標(biāo)本的途徑主要有：（1）獲取精子或卵子進(jìn)行診斷，（2）獲取植入前的胚胎細(xì)胞進(jìn)行DNA或染色體分析。

　　受精前取配子進(jìn)行診斷的報道，目前尚不多。這種方法關(guān)鍵在于如何完成精子或卵子的遺傳分析，同時又不影響其受精能力。已有報道，用流式細(xì)胞儀分離X、Y精子，用于植入前篩選胎兒的性別。而用卵子進(jìn)行PGD，主要是利用第一極體或第二極體的遺傳學(xué)分析，間接推斷卵子正常與否。現(xiàn)在，可以利用極體的DNA進(jìn)行單基因病的診斷，也可以用核轉(zhuǎn)換技術(shù)，將極體由間期激活成中期，再用CGH技術(shù)分析其所有的染色體組成，或直接對極體的某些染色體進(jìn)行FISH分析，診斷這些染色體有無數(shù)目異常。但是，用極體分析來推斷卵子的基因組或其染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目，并不能完全反映卵子遺傳組成的真實(shí)情況，有時也必須同時分析第一極體和第二極體，才能判斷卵子的染色體有無異常。

　　卵裂球活檢是現(xiàn)在PGD取材的主要途徑。一般選6～10細(xì)胞期的卵裂球，此期的細(xì)胞具有全能分化的潛能，取出1～2個細(xì)胞，不會影響胚胎的發(fā)育。

　　囊胚期活檢是PGD診斷的另一潛在途徑。這種方法是在體外將受精卵培養(yǎng)到囊胚期，取其滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞進(jìn)行遺傳分析。因?yàn)椴挥绊憙?nèi)細(xì)胞團(tuán)，故不會累及胚胎發(fā)育。受培養(yǎng)技術(shù)的限制，多數(shù)胚胎不能在體外很好地發(fā)育到囊胚期。因此，無法獲取囊胚期細(xì)胞進(jìn)行PGD.最近，Veiga等（1999年）改進(jìn)了培養(yǎng)方法，在體外培育后，可達(dá)到囊胚期的胚胎占39.3%，推測囊胚期活檢有望成為一種有效的取材方法。雖然取一定數(shù)量的囊胚期細(xì)胞不會影響胚胎的正常發(fā)育，但內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞的遺傳構(gòu)成并非完全相同，故用滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞進(jìn)行PGD有可能造成誤診。診斷時分別用幾個細(xì)胞分析比用單個細(xì)胞診斷的方法更好，可以降低誤診率。

　　2.基因病診斷：目前可診斷的單基因病包括地中海貧血，纖維囊性化，脆性X綜合征，以及和性連鎖遺傳病有關(guān)的性別診斷等，可診斷的病種數(shù)目在不斷增加。所用的方法主要是基于PCR技術(shù)的DNA分析，通過檢測單細(xì)胞靶基因的數(shù)目及結(jié)構(gòu)有無異常加以診斷。常規(guī)的PCR技術(shù)易受實(shí)驗(yàn)條件的影響，故從90年代后期開始，熒光PCR，多重PCR，巢式PCR技術(shù)用于PGD診斷的報道逐漸增加，有效地提高了診斷率。

　　染色體數(shù)目異常的診斷有兩種途徑：用傳統(tǒng)的染色體計數(shù)及用熒光PCR進(jìn)行多態(tài)位點(diǎn)定量分析。熒光PCR是近年發(fā)展起來的新技術(shù)，敏感度很高。對多細(xì)胞水平的定量分析來說，它是一種穩(wěn)定可靠的技術(shù)，但因選擇性擴(kuò)增的緣故，單細(xì)胞的定量分析中有25%的診斷結(jié)果不可靠。熒光PCR已用于21三體的植入前診斷。隨著熒光PCR定量檢測技術(shù)的廣泛應(yīng)用，現(xiàn)正在開發(fā)一種同步檢測技術(shù)，以便實(shí)時測定熒光PCR的擴(kuò)增效果，并進(jìn)一步提高其診斷的可靠性，促進(jìn)該技術(shù)的臨床應(yīng)用。

　　在基因病診斷以及染色體病診斷的過程中，主要的限制因素之一是，如何獲取滿足診斷需求的DNA.解決的途徑主要靠WGA.WGA目前常用的方法有兩種：簡并寡核苷酸引物PCR（degeneratedoligonucleotideprimedPCR，DOP-PCR）法及擴(kuò)增前引物延伸法（primerexteionpreamplification，PEP）。用WGA法能夠無選擇偏見地擴(kuò)增整個基因組。從理論上講，任何基因都能從WGA的產(chǎn)物中檢測出來。同時也可將信息保存起來。目前，WGA尚未廣泛用于臨床，但是對多基因病診斷的要求及CGH技術(shù)的發(fā)展，勢必要求WGA技術(shù)不斷地完善，并推動其臨床應(yīng)用。

　　3.染色體病的診斷：在植入前遺傳學(xué)診斷領(lǐng)域，染色體病的診斷占了很大的比例。CGH和間期細(xì)胞核轉(zhuǎn)換技術(shù)的應(yīng)用，標(biāo)志著染色體分析技術(shù)可能有了一種通用的程序。然而，F(xiàn)ISH仍是目前診斷染色體病的主要方法。主要用來診斷非整倍體，特別是13、18、21、X和Y染色體的數(shù)目異常。用雙色、多色探針可以在單細(xì)胞水平診斷染色體數(shù)目畸變。既可以用不同的探針同步雜交單一細(xì)胞核，也可用重復(fù)雜交同一細(xì)胞核的方法完成診斷。染色體結(jié)構(gòu)異常，例如平衡易位攜帶者可用其卵裂球或極體進(jìn)行PGD.羅氏易位的診斷可用商售的探針進(jìn)行。最常見也最難診斷的是相互易位，需要進(jìn)行染色體涂抹，同時還要進(jìn)行著絲粒及近端粒探針雜交以確定染色體斷裂位點(diǎn)。由于斷裂位點(diǎn)的不可預(yù)見性，相互易位很難制備商售的探針。因此，相互易位的診斷耗時、費(fèi)力，操作也比較困難。

　　用常規(guī)FISH僅能分析有限的染色體，對相互易位等復(fù)雜畸變不易診斷。因此人們用早熟染色體凝集技術(shù)將間期細(xì)胞核轉(zhuǎn)換成中期細(xì)胞核，然后分析其染色體數(shù)目及結(jié)構(gòu)有無異常，以達(dá)到診斷目的。Verliky將極體或卵裂球注入到去核卵子或去核的受精卵中，電刺激使之融合，利用胞質(zhì)內(nèi)的因素促使極體或卵裂球轉(zhuǎn)化成分裂狀態(tài)。這樣得到的染色體可用于染色體涂抹，多色FISH或光譜核型（SKY）分析，因?qū)宿D(zhuǎn)變技術(shù)要求高、耗時、易受制備因素的影響，也受到倫理因素的制約，使其發(fā)展受限。CGH是另一種很有希望的診斷染色體異常的技術(shù)。用WGA方法獲取基因組DNA，然后用雜交技術(shù)結(jié)合計算機(jī)分析可診斷任何超過20Mb的染色體區(qū)域的拷貝數(shù)有無異常，從而診斷染色體玻影響CGH的主要因素是如何得到足夠的DNA.一般要求100ng～1μgDNA，大約相當(dāng)1萬個細(xì)胞所含的DNA量。應(yīng)該強(qiáng)調(diào)的是，用WGA獲取足夠數(shù)量DNA的同時，還要確保得到的DNA是準(zhǔn)確的復(fù)制品。制約CGH臨床應(yīng)用的另一因素是診斷時間必須縮短，目前的診斷時間大約是7d左右，尚不能滿足臨床的需要。

　　4.其他方面：PGD除了用于遺傳病診斷之外，也可應(yīng)用于研究人類基因，特別是一些有特殊遺傳缺陷的基因，在發(fā)育早期的表達(dá)。這對于了解人類胚胎的正常發(fā)育有重要意義。例如對PGD技術(shù)用于人類腫瘤易感綜合征的易感性分析。與腫瘤有關(guān)的各種抑癌基因與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡的途徑及胚胎分化的時機(jī)和極性都有密切的關(guān)系。Sutterlin（1999年）等用巢式PCR和單鏈多態(tài)性分析技術(shù)，對單細(xì)胞進(jìn)行視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的易感性分析，在植入前確定胚胎未來發(fā)生腫瘤的可能性大小，為PGD應(yīng)用于人類胚胎基因表達(dá)的研究開辟了暫新的途徑。此外，Delhanty等發(fā)現(xiàn)，體外受精的胚胎存在染色體嵌合現(xiàn)象，雖然還不清楚自然受精的胚胎是否也有同樣問題，但是這些發(fā)現(xiàn)無疑對改進(jìn)診斷程序設(shè)計，甚至在將來改善體外受精的成功率都有重要意義。醫(yī)學(xué)教育網(wǎng)搜集整理

　　二、存在的問題與解決方法

　　1.等位基因脫失：等位基因脫失（alleledrop-out，ADO）是影響基因病診斷的主要因素之一。發(fā)生率約為5%～20%.它是指兩個等位基因只能擴(kuò)增出1個，另1個不能擴(kuò)出或擴(kuò)增的數(shù)量有限，達(dá)不到診斷的水平。這對于單一基因異常所致的遺傳病如常染色體顯性遺傳病的診斷有較大影響，容易導(dǎo)致誤診。單純應(yīng)用PCR技術(shù)診斷胚胎的性別，也易因ADO而造成誤診。用多重PCR方法擴(kuò)增致病基因及其緊密連鎖的多態(tài)片段，可以降低因ADO而造成的誤診率。此外，改進(jìn)樣本的制作及用熱啟動PCR，也可減少ADO的發(fā)生率。Roy（1999年）發(fā)現(xiàn)，用設(shè)計好的引物，嚴(yán)格的操作及固定專人及專門用于PGD的設(shè)施，單細(xì)胞PCR也可收到良好的效果。

　　2.污染：這是影響基因病診斷，產(chǎn)生誤診及診斷失敗的另一個重要因素。污染物主要來源于透明帶內(nèi)殘余的精子及母體的卵泡細(xì)胞。前者可用單精子胞漿注射的方法避免，后者可用多重PCR同時檢測胎兒及其父母的DNA指紋加以鑒別。前次診斷殘留的擴(kuò)增產(chǎn)物，是污染物的另一來源，除了按PCR常規(guī)嚴(yán)格操作之外，用巢式PCR或熒光PCR對減少此類污染很有幫助。

　　3.FISH的有關(guān)問題：首先是用FISH診斷與年齡有關(guān)的非整倍體是否應(yīng)作為常規(guī)尚有爭論。這方面需要進(jìn)一步的研究。FISH的錯誤率約為15%.體外受精期的嵌合體發(fā)生率較高、FISH信號尚缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)等問題都是影響FISH診斷率的因素，這些問題的解決有賴于多中心大規(guī)模的合作研究，以確定合理的分析標(biāo)準(zhǔn)及標(biāo)準(zhǔn)化的操作程序。

　　4.多基因異常的診斷問題：涉及多個突變位點(diǎn)的單基因病診斷、多基因病診斷、染色體組分析如CGH，都要求獲得足夠的DNA.目前，相關(guān)的研究集中在用DOP-PCR或PEP方法擴(kuò)增單細(xì)胞DNA方面。DOP-PCR的擴(kuò)增效率在80%左右，選擇合適的引物有望進(jìn)一步提高擴(kuò)增效率。

　　5.診斷取材：現(xiàn)行植入前遺傳病診斷，主要利用卵裂球的DNA進(jìn)行分子診斷或用間期FISH診斷染色體數(shù)目異常。與之相比，用囊胚期細(xì)胞進(jìn)行診斷，可以分析多個細(xì)胞，提高診斷率。利用聯(lián)合培養(yǎng)或順序培養(yǎng)（sequentialculture）能夠提高囊胚期細(xì)胞培養(yǎng)的成功率。醫(yī)學(xué)教育網(wǎng)搜集整理

　　三、展望

　　在過去的10年里，PGD取得了顯著的成績，展望未來，PGD技術(shù)可望在下述方面進(jìn)一步發(fā)展。

　　1.多重突變分析：利用多重PCR、CGH、WGA，以及間期核轉(zhuǎn)換技術(shù)，人們已經(jīng)能夠診斷涉及不同位點(diǎn)的突變以及全染色體核型分析。但是，這方面的診斷仍受到一定限制。目前，國外一些研究中心正在探索DNA芯片技術(shù)在PGD領(lǐng)域的應(yīng)用前景。利用這種技術(shù)，可以同時分析單一細(xì)胞內(nèi)上千種基因突變，能夠極大地提高診斷效率。此外，變性梯度凝膠電泳及單鏈多態(tài)分析技術(shù)也正受到廣泛關(guān)注。在不遠(yuǎn)的將來，單細(xì)胞將可能有效地用于診斷多個突變或染色體組核型分析。

　　2.診斷標(biāo)準(zhǔn)化：目前，在世界范圍內(nèi)要求PGD的人越來越多，已有的研究中心無法滿足需要，客觀上要求將PGD的診斷程序標(biāo)準(zhǔn)化。在我國，PGD的相關(guān)研究尚處在初始階段，鑒于我國經(jīng)濟(jì)基礎(chǔ)比較薄弱，遺傳病散在發(fā)生的特點(diǎn)，很有必要集中人力、物力，建立各大區(qū)的植入前診斷中心，這對于規(guī)范診斷標(biāo)準(zhǔn)，加強(qiáng)管理，提高診斷水平有重要意義。

　　3.倫理學(xué)研究：PGD中不可避免地涉及有關(guān)倫理學(xué)問題，例如植入前診斷中的性別選擇，腫瘤易感性分析都會激起廣泛的興趣。

　　4.相關(guān)領(lǐng)域研究：在胚胎期發(fā)現(xiàn)染色體嵌合、人類胚胎體外的有效培養(yǎng)和定向誘導(dǎo)分化、人體基因在胚胎早期的特異表達(dá)與PGD的深入研究及發(fā)展有密切關(guān)系。人類胚胎體外的有效培養(yǎng)和定向誘導(dǎo)分化，可望使人類能夠移植自身的組織或臟器，從而大大提高器官移植的成功率。許多腫瘤易感綜合征的發(fā)病都是遲發(fā)性的，并且可以用外科手術(shù)進(jìn)行治療；也并非所有攜帶腫瘤易感基因的個體都會發(fā)生惡性腫瘤；PGD可能會使這部分人在得知自身有較高遺傳易感性，容易發(fā)生惡性腫瘤的情況后，注重采取有效的預(yù)防措施避免腫瘤的發(fā)生。另一方面，有些腫瘤綜合征例如視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤發(fā)病早，外顯率高甚至完全外顯；有些呈多臟器原發(fā)腫瘤因而需要多次手術(shù)；這部分人行PGD可能會帶來一些問題，例如會使當(dāng)事者產(chǎn)生心理及情感上的巨大壓力。因此，上述情況是否都適合于進(jìn)行植入前診斷，在倫理學(xué)方面有較大的爭議。可以預(yù)見這方面的研究將是熱點(diǎn)之一。醫(yī)學(xué)教育網(wǎng)搜集整理

　　PGD已在全球50多個診斷中心開展，并已經(jīng)積累了一些經(jīng)驗(yàn)。PGD是一種可行的產(chǎn)前診斷技術(shù)，但是PGD中心相對來說還很少，特別在國內(nèi)更是如此，亟待發(fā)展。我們相信在不遠(yuǎn)的將來，PGD將成為一種標(biāo)準(zhǔn)的產(chǎn)前診斷技術(shù)，并造福于人類。