目的:比較黃藤素片微生物方法驗(yàn)證中的加菌方法不同,所出現(xiàn)的回收率差異。方法:采用離心法薄膜過濾法棄除黃藤素片中的抑菌成分。結(jié)果:離心前加入陽性對照菌所得回收率非常低,采用薄膜過濾法的陽性對照菌所得回收率可達(dá)70%以上,兩者有顯著性差異。結(jié)論:薄膜過濾法最后一次沖洗加入陽性對照菌僅能說明黃藤素片的抑菌作用可采用離心薄膜過濾法棄除,而不能反映該藥品在生產(chǎn)、運(yùn)輸、貯藏過程所污染的微生物。 2005版《中國藥典》在藥品微生物限度檢驗(yàn)方法項(xiàng)下增加了方法學(xué)驗(yàn)證的內(nèi)容,特別對有抑菌作用的藥品指出可采用離心沉淀集菌法、薄膜過濾法或聯(lián)合使用這些方法消除抑菌作用,并要求陽性菌的加入方法是最后一次濾膜沖洗時。針對黃藤素片的抑菌情況,筆者采用離心薄膜過濾法消除其抑菌,并就其加入陽性對照菌的方法進(jìn)行了比較,發(fā)現(xiàn)加入陽性對照菌的方法不同,所得到的回收率差異是非常顯著的。
1.1試驗(yàn)材料
1.1.1樣品黃藤素片分別由玉溪維和制藥有限公司(批號20040113,樣品1)、昆明制藥有限公司(批號20040452,樣品2)、云南滇池制藥有限公司(批號20040701,樣品3)提供。
1.1.2稀釋劑及培養(yǎng)基無菌磷酸鹽緩沖液(pH7.2)按藥典配制,TTC營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基均來源于北京三藥科技開發(fā)公司。
1.1.3陽性對照菌大腸桿菌[CMCC(B)44102]、金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]、白色念珠菌[CMCC(F)98001],由中國藥品生物制品檢定所提供。
1.2.1供試品的制備分別取樣10g,勻漿后加入無菌磷酸鹽緩沖液(pH7.2)至100mL,制成1∶10供試液備用。
1.2.2陽性菌液制備取相應(yīng)菌株的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面新鮮培養(yǎng)物1白金耳,接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi),培養(yǎng)18~20h后用無菌磷酸鹽緩沖液(pH7.2)稀釋至相應(yīng)的濃度,備用。
1.2.3試驗(yàn)Ⅰ組分別吸取1∶10約含50~100個/mL陽性菌的供試液10mL,置無菌離心管中,經(jīng)500r/min離心5min后,以無菌操作取上清液1mL置無菌磷酸鹽緩沖液(pH7.2)100mL中,加入裝有直徑為50mm、孔徑為(0.45±0.02)μm的微孔濾膜的過濾器內(nèi),減壓抽干后,用無菌磷酸鹽緩沖液(pH7.2)沖洗濾膜3次,每次50~100mL,取出濾膜,按上述操作分別進(jìn)行5次,各置5皿,再注入約45℃的TTC營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約15mL,混勻,37℃培養(yǎng)48h后計(jì)數(shù)。
1.2.4試驗(yàn)Ⅱ組分別吸取1∶10供試液10mL置無菌離心管中,經(jīng)500r/min離心5min后,以無菌操作取上清液1mL置無菌磷酸鹽緩沖液(pH7.2)100mL中,加入裝有直徑為50mm孔徑為(0.45±0.02)μm的微孔濾膜的過濾器內(nèi),減壓抽干后,用無菌磷酸鹽緩沖液(pH7.2)沖洗濾膜3次,每次50~100mL,最后一次沖洗時同時加入1mL約含50~100個/mL陽性菌菌液,取出濾膜,按上述操作分別進(jìn)行5次,各置5皿,再注入約45℃的TTC營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約15mL,混勻,37℃培養(yǎng)48h后計(jì)數(shù)。
1.2.5供試品對照組分別吸取1∶10的供試液10mL,經(jīng)500r/min離心5min后,以無菌操作取上清液1mL置無菌磷酸鹽緩沖液(pH7.2)100mL中,搖勻,以無菌操作加入裝有直徑為50mm孔徑為(0.45±0.02)μm的微孔濾膜的過濾器內(nèi),減壓抽干后,用無菌磷酸鹽緩沖液(pH7.2)沖洗濾膜3次,每次50~100mL,取出濾膜,按上述操作分別進(jìn)行5次,各置5皿,再注入約45℃的TTC營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約15mL,混勻,37℃培養(yǎng)48h后計(jì)數(shù)。
1.2.6陽性對照組取制備好的約含50~100個/mL的陽性菌菌液1mL,置于平皿中,分別置5皿,再注入約45℃的TTC營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約15mL,混勻,37℃培養(yǎng)48h后計(jì)數(shù)。
1.2.7陰性對照組取試驗(yàn)用的稀釋液10mL,照上述離心薄膜過濾法操作,作為陰性對照。
2.1藥典常規(guī)方法結(jié)果采用2005年版《中國藥典》常規(guī)方法檢測三個批號黃藤素片陽性菌回收率,在1∶10的稀釋級僅只有大腸桿菌加菌的回收率能達(dá)到70%以上,而在1∶10、1∶100的稀釋級加入其他三種標(biāo)準(zhǔn)菌,其回收率均遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于70%。說明樣品有很強(qiáng)的抑菌作用,因此黃藤素片的微生物限度檢測不能采用常規(guī)方法檢測。
2.2不同加菌方法陽性對照菌回收率由于金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌在1∶10、1∶100的回收率無法達(dá)到藥典要求,且黃藤素片中含有一定的輔料,故改用離心薄膜過濾法測定。
采用離心薄膜過濾法消除黃藤素片的抑菌作用,若在離心前加入陽性對照菌,4種陽性標(biāo)準(zhǔn)菌的回收率非常低,這可能與離心沉降以及操作轉(zhuǎn)移過程中陽性菌的損失和黃藤素片供試液對陽性菌液存活率的影響有關(guān)。在薄膜過濾的最后一次沖洗時加入陽性菌,上述4種陽性菌的回收率均達(dá)到70%以上。兩種方法回收率的差距甚遠(yuǎn)。在薄膜過濾法最后一次沖洗時加入陽性對照菌,盡管回收率已達(dá)到了中國藥典2005版微生物限度檢驗(yàn)驗(yàn)證方法的要求,但這僅只能說明該藥品的抑菌作用可采用離心薄膜過濾法去除,而不能反映該藥品在生產(chǎn)、運(yùn)輸、貯藏過程中污染的微生物,因?yàn)樗廴镜奈⑸锟赡茉跅壋志奶幚磉^程中有損失。盡管采用離心薄膜過濾法棄除藥品中的抑菌作用是非常有效的處理辦法,但筆者認(rèn)為本法僅考慮到消除藥品的抑菌作用而忽略了采用該法可能導(dǎo)致藥品在生產(chǎn)、運(yùn)輸、貯藏過程污染的微生物在處理過程中損失的情況。鑒于微生物的特殊性,目前微生物檢驗(yàn)方法非常局限,如何能既消除藥品的抑菌作用同時又能保證在生產(chǎn)、運(yùn)輸、貯藏過程污染的微生物不損失,還有待進(jìn)一步研究。