血吸蟲病查病技術(shù)規(guī)范

1 查病對象和頻次

1.1 一類流行村每年對6～65歲常住居民采用詢檢法查病1～2次，受檢率達90％以上。

1.2 二類流行村每年傳播季節(jié)結(jié)束后1個月，對有疫水接觸史的6～65歲常住居民采用血清學方法查病1次，受檢率達90％以上。

1.3 三類流行村每2年在傳播季節(jié)結(jié)束后，對有疫水接觸史的6～65歲常住居民采用血清學方法查病1次，受檢率達90％以上。

1.4 四類流行村每3年對有釘螺分布的村民組和有疫水接觸史的6～65歲常住居民，采用血清學方法查病1次，受檢率均達90％以上。對當年檢獲感染性釘螺的村，采用血清學方法對相關(guān)村民組6～65歲常住居民查病1次，受檢率達90％以上。

1.5 五類流行村對當年檢獲釘螺的村，采用血清學方法對相關(guān)村民組6～65歲常住居民查病1次，受檢率均達90％以上。

1.6 對有疫水接觸史的流動人群，每年采用詢檢法或血清學方法查病1次。

2 查病方法

2.1 詢檢法

主要是詢問受檢人員在末次治療后，近1～2年有無疫水接觸史及有無發(fā)熱、腹瀉等主要血吸蟲病癥狀。

2.1.1 材料準備

聽診器、血壓計、詢檢法調(diào)查登記表。

2.1.2 操作步驟

2.1.2.1 應仔細詢問受檢者血吸蟲病查治史、末次治療時間及此后接觸疫水地點、時間、接觸方式及出現(xiàn)的癥狀。

2.1.2.2 必要的體格檢查排除其他非血吸蟲病引起的發(fā)熱、腹瀉、肝腫大等臨床癥狀體征。

2.1.3 診斷標準

末次治療后，近1～2年內(nèi)有疫水接觸史或疑似血吸蟲病癥狀，定為本法陽性。

2.1.4 注意事項

2.1.4.1 應注意受檢者接觸水體地點周圍的釘螺分布變遷及現(xiàn)狀。

2.1.4.2 避免誘導性詢問血吸蟲病出現(xiàn)的臨床癥狀和體征。

2.2 血清學方法

根據(jù)抗原和特異性抗體結(jié)合原理，用已知抗原（抗體）和采集的人體血清進行體外檢測抗體（抗原）的方法。目前人群查病常用的血清學方法有如下幾種，可選任何一種方法進行病情調(diào)查，由于血清學方法存在諸多不確定因素，一般不用于效果評價。

2.2.1 環(huán)卵沉淀試驗（COPT）

2.2.1.1 材料準備

抗原（熱處理超聲干燥蟲卵粉）、石蠟、載（蓋）玻片、顯微鏡、溫箱、離心機、滴管、塑料管、針頭等。

2.2.1.2 操作步驟

采集獲取受檢者血清，用熔化的石蠟在潔凈的載玻片兩端分別劃兩條相距20mm的蠟線，在蠟線之間加受檢者血清2滴（0.05～0.10ml），然后用針頭挑取干卵約100～150個，加入血清中，混勻，覆以24mm×24mm蓋玻片，四周用液化石蠟密封后，置于37℃溫箱中，經(jīng)48～72h后用低倍（80～100×）顯微鏡觀察反應結(jié)果，疑似者應在高倍（400×）顯微鏡下加以鑒別。

2.2.1.3 結(jié)果判斷

2.2.1.3.1 陽性反應

蟲卵周圍產(chǎn)生邊緣較整齊、光滑，并有明顯折光的泡狀、指狀或細長卷曲的帶狀沉淀物。其中泡狀沉淀物須大于10μm（約相當于兩個紅細胞大?。?，才能定為陽性，記錄發(fā)生陽性反應的蟲卵數(shù)，按下式計算環(huán)沉率。

環(huán)沉率（%）＝（陽性蟲卵數(shù)/全片觀察正常蟲卵數(shù)）×100

2.2.1.3.2 陰性反應

蟲卵周圍光滑，無沉淀物。或有小于10μm的泡狀沉淀物。

2.2.1.4 診斷標準

環(huán)沉率≥3%定為本方法檢查陽性。

2.2.1.5 注意事項

2.2.1.5.1 干卵應以重感染兔血清（感染1500～2000條尾蚴的兔血清）測試，環(huán)沉率＞30%者為合格抗原。

2.2.1.5.2 劃蠟線應將石蠟加熱至開始冒煙時，用棉簽蘸蠟一次劃成，以保證蠟線厚薄均勻，蠟線不宜過厚，線間距離不宜小于20mm.

2.2.1.5.3 在試驗血清中挑入干卵數(shù)不宜過多，以100～150個為宜，并使蟲卵均勻分散，切勿成團塊。

2.2.1.5.4 宜用24×24mm（或22×22mm）的蓋玻片覆蓋，一次蠟封，以避免密封不嚴，影響反應結(jié)果。

2.2.1.5.5 檢測Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ類流行村人群時，蟲卵孵育時間可酌情延長到72h，以便提高陽性檢出率。

2.2.1.5.6 要善于識別粘附于干卵周圍的紅細胞、組織碎片及從卵殼破裂處滲出的毛蚴組織等，通常在高倍鏡觀察時，易于識別這些物質(zhì)。

2.2.1.5.7 已檢查完畢的標本片，可用3％甲酚皂（來蘇爾）溶液浸泡1～2天，待蓋玻片脫開后，分別清洗，拭干備用。

2.2.1.5.8 不成熟蟲卵、破卵不計算在被觀察的蟲卵總數(shù)內(nèi)。

2.2.1.5.9 國內(nèi)有關(guān)COPT的操作方法較多，除上述常用方法外，還有塑料管法、雙面膠紙條法、PVC薄膜抗原片法、PVF抗原片法，血凝板法，以及IEST法等都可選用，陽性標準與常用玻片法相同。

2.2.2 間接血球凝集試驗（IHA）

2.2.2.1 材料準備

可溶性血吸蟲卵抗原致敏的凍干“O”型紅細胞或綿羊紅細胞、V形微量反應板、塑料管、采血針、酒精棉球、微量滴管、生理鹽水、離心機等。

2.2.2.2 操作步驟

2.2.2.2.1 采集獲取受檢對象血清。

2.2.2.2.2 配置致敏紅細胞懸液：取凍干致敏紅細胞1支，每支加用致敏紅細胞稀釋液1ml，充分混勻。

2.2.2.2.3 血凝板的第1列第1孔加標本稀釋液100μl（4滴），第2～4孔加標本稀釋液25μl（1滴）。于第1孔加25μl（1滴）待測血清，充分混勻后吸出25μl于第2孔，第2孔充分混勻后依次倍比稀釋至第4孔，在第4孔混勻后棄去多余的25μl （1滴），然后將第1孔吸取75μl棄去，第1～4孔血清稀釋度分別為1：5、1：10、1：20和1：40.

2.2.2.2.4 于稀釋后的每孔血清加致敏紅細胞懸液25μl（1滴），震搖1～2min，置37℃，30min后觀察結(jié)果。

2.2.2.2.5 每次試驗均應設(shè)陰性、陽性對照。陽性、陰性對照血清為凍干品，使用前每管加100μl蒸餾水稀釋，充分溶解后使用。

2.2.2.3 結(jié)果判斷

2.2.2.3.1 陰性反應

紅細胞全部沉入孔底，肉眼見一邊緣光滑，致密的小圓點。

2.2.2.3.2 陽性反應：紅細胞成明顯顆粒凝集散布于孔底，周圍不形成致密的圓點，強陽性時凝集物邊緣形成不規(guī)則的皺褶。

2.2.2.4 診斷標準

以血清1：10稀釋出現(xiàn)陽性反應可判為本法陽性。

2.2.2.5 注意事項

2.2.2.5.1 受檢者血清以1：10稀釋，出現(xiàn)陽性反應作為陽性反應的起點較為適宜。

2.2.2.5.2 凍干致敏紅細胞于4℃可較長時期保存，其效價不變。室溫中保存則不宜超過3個月。

2.2.2.5.3 待測血清標本以新鮮血清為宜。

2.2.2.5.4 實驗時宜選用V形血凝反應板，形成終點快判斷結(jié)果準。

2.2.2.5.5 因批號不同抗原效價有很大差異，應在查病前做效價測定，合格后方可使用。

2.2.2.5.6 用過的微量血凝反應板不能浸泡于酸、堿溶液中，也不能用毛刷洗擦，必須用高壓自來水將沉積孔底的紅細胞沖洗干凈，再以蒸餾水洗2～3次，晾干使用。急用時可將洗凈的反應板置37℃溫箱烘干。

2.2.2.5.7 必要時使用一次性反應板。

2.2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）

2.2.3.1 材料準備

可溶性血吸蟲卵抗原、聚苯乙烯塑料微量板、定量吸管、緩沖液和有關(guān)化學試劑、冰箱、恒溫箱、ELISA檢測儀等。

2.2.3.2 操作步驟

2.2.3.2.1 采集獲取受檢對象血清

2.2.3.2.2 于聚苯乙烯塑料微量板的凹孔中加入0.2ml以pH9.6碳酸鹽緩沖液作1∶3000（或1∶1000，隨抗原效價而定）稀釋的蟲卵抗原，置4℃過夜。

2.2.3.2.3 次日傾去抗原，用含有0.05％吐溫-20的磷酸緩沖鹽水（PBS/TpH7.4，0.01mol/L）洗滌3次，每次5min.

2.2.3.2.4 于凹孔中加入以PBS/T作1∶200稀釋的受檢者血清0.2ml，37℃ 2h.

2.2.3.2.5 傾去血清，以PBS/T洗滌3次，每次5min.

2.2.3.2.6 加入以PBS/T作1∶1000稀釋的辣根過氧化物酶（HRP）-標記結(jié)合物0.2ml，37℃，2h.

2.2.3.2.7 傾去酶標記結(jié)合物，以PBS/T洗滌3次，每次5min.

2.2.3.2.8 加入0.2ml鄰苯二胺（OPD）底物溶液〔10mg OPD＋pH5.0檸檬酸緩沖液25ml＋30％過氧化氫10μl〕0.2ml，37℃，30min.

2.2.3.2.9 在各凹孔中加入2mol/L硫酸0.05ml以終止反應。

在酶標專用比色計上讀取492nm光密度（OD）值。

2.2.3.2.10 每次實驗均設(shè)陽性參考血清對照，同法求出其OD值。以此對樣本血清OD值進行校正。

2.2.3.3 診斷標準

2.2.3.3.1 Dynatech酶標專用比色計：測定結(jié)果OD值≥0.5為血吸蟲陽性。

2.2.3.3.2 目測

受試血清凹孔中所顯示的顏色淺于陰性對照血清顏色一個滴度者為血吸蟲陽性。

2.2.3.4 注意事項

2.2.3.4.1 試驗時，每塊反應板均應設(shè)標準參考陽性血清及陰性血清對照。

2.2.3.4.2 試驗時，加底物前，反應板經(jīng)洗滌、甩干后，不宜在空氣中暴露過久，應速加底物，以免影響酶的活力而影響結(jié)果。

2.2.3.4.3 酶結(jié)合物濃度很重要，必須準確配制。

2.2.3.4.4 每次洗滌一定要干凈，否則影響結(jié)果。

2.2.3.4.5 配制試劑的器皿最好能固定使用，不要經(jīng)常更換。

2.2.3.4.6 目前國內(nèi)有關(guān)改進ELISA的方法較多，除上述常用方法外，還有PVC薄膜快速ELISA法等選用。

2.2.4 膠體染料試紙條法（DDIA）

2.2.4.1 材料準備

試紙條、染料標記抗原1，PVC小杯（有試劑盒供應）。

2.2.4.2 操作步驟

2.2.4.2.1 采集獲取受檢對象血清。

2.2.4.2.2 待檢血清l0μl置檢測PVC小杯中，另加入50μl標記染料的抗原液，輕輕混勻約1min.

2.2.4.2.3 取試紙條插入小杯中，約5～l0min.

2.2.4.2.4 待小杯內(nèi)反應液吸干后（10 min左右）觀察結(jié)果。

2.2.4.3 結(jié)果判斷

2.2.4.3.1 陽性反應

檢測帶和對照帶均顯紫藍色的沉淀帶。

2.2.4.3.2 陰性反應

對照帶顯示紫藍色沉淀帶而檢測帶無紫藍色。

2.2.4.4 診斷標準

出現(xiàn)陽性反應者可定為本法血吸蟲陽性。

2.2.4.5 注意事項

2.2.4.5.1 檢測血清必須新鮮，否則會影響檢測結(jié)果。

2.2.4.5.2 取試紙條時，用手捏住吸水墊（較長的一端），嚴禁觸摸檢測膜。

2.2.4.5.3 試紙條一定要插入杯底。

2.2.4.5.4 檢測帶反應過強時，對照帶顯色會減弱，甚至不顯色，此結(jié)果仍判斷為陽性反應。

2.2.4.5.5 該試紙條法與肺、肝吸蟲病人血清有部分交叉反應，檢測時應加注意。

2.2.4.5.6 試劑盒在4℃可保存6個月。

2.3 病原學方法

目前在人群查病時運用的病原學方法是糞便檢查法，在實際工作中可選用以下任何一種糞檢方法。

2.3.1 尼龍袋集卵孵化法

2.3.1.1 器材準備

40～60目/英寸銅絲篩、260目/英寸尼龍絹袋、250ml三角燒杯、搪瓷杯、竹筷、尼龍絹袋支架、淋水用橡皮管、水桶、明礬、漂白粉等。

2.3.1.2 操作步驟

2.3.1.2.1 取受檢者糞便約30g，先置于40～60目/英寸的銅絲篩中，銅絲篩置于下口夾有鐵夾的尼龍絹（260目/英寸）袋口上，淋水調(diào)漿，使糞液直接濾入尼龍絹袋中，然后移去銅絲篩，繼續(xù)淋水沖洗袋內(nèi)糞渣，并用竹筷在袋外輕輕刮動助濾，直到濾出液變清。取下夾于袋底下口的鐵夾，將袋內(nèi)沉渣淋洗入三角燒瓶（若需加做沉渣鏡檢，可在燒瓶中吸取沉渣3～4滴放在載玻片上，抹成涂片兩張置于低倍顯微鏡下檢查，每片鏡檢時間不宜少于2min）。

2.3.1.2.2 將盛有糞便沉渣的三角燒瓶加水至離瓶口1cm處，放入孵化室（箱）或在室溫下孵化，最適宜的孵化溫度為22～26℃。

2.3.1.2.3 觀察毛蚴宜在孵化后1、3、5h各1次。

2.3.1.3 診斷標準

發(fā)現(xiàn)血吸蟲（蟲卵）毛蚴即為血吸蟲病人。

2.3.1.4 注意事項

2.3.1.4.1 觀察毛蚴時，應將燒瓶向著光源，并襯以黑紙板。要注意毛蚴與水中原生動物的區(qū)別。如有懷疑，可用毛細吸管吸出，在顯微鏡下鑒別。

2.3.1.4.2 糞便必須新鮮，夏季不宜超過l2h，冬季不宜超過24h，糞量不足30g的應退回再送。

2.3.1.4.3 切勿用農(nóng)藥、化肥或其他化學品的紙張包糞便。

2.3.1.4.4 孵化用自來水時，一般要將水過夜脫氯；急用時可在水中加入少量硫代硫酸鈉（每50kg水中，加入硫代硫酸鈉0.2～0.4g）除氯半小時后使用。如用河水或井水，可將水加熱至60℃或經(jīng)過濾，以除去水蟲。也可每50kg水用漂白粉0.35g（漂白粉精0.17g）殺蟲。

2.3.1.4.5 為了澄清河水，每50kg水可加入明礬1.5～2.0g（濃度超過0.02%以上時，對蟲卵孵化有抑制作用）。

2.3.1.4.6 被工業(yè)廢水、化肥和農(nóng)藥污染的水和含鹽量較高的水都不宜用于孵化。

2.3.1.4.7 溫度是促使蟲卵孵化的必要條件，25℃左右最適宜。室溫在20℃以下或更低時，必須加溫，一般采用簡化的土孵化室或孵化箱，使孵化環(huán)境能保溫在25℃左右。

2.3.1.4.8 一切糞檢用具每次用后都必須洗刷3次，洗凈后用60～80℃熱水浸泡殺卵，避免交叉污染。

2.3.1.4.9 殘余的糞便、糞渣、糞水和沉渣等必須倒入指定的沉淀糞池中貯存或用藥物殺卵，以防病原擴散。

2.3.1.4.10 尼龍絹袋使用過久，孔目變形或孔目破損者要及時剔除，以免影響效果。

2.3.2 改良加藤厚涂片法

2.3.2.1 器材準備

甘油孔雀綠溶液、親水性玻璃紙、定量板、尼龍絹片、載玻片、塑料刮片等。

2.3.2.2 操作步驟

2.3.2.2.1 置尼龍絹片于受檢糞樣上，用軟性塑料刮片在尼龍絹片上輕刮，糞便細渣即由絹片微孔中露至絹片表面。

2.3.2.2.2 將定量板（3×4×2.5cm，板中圓孔的孔徑為3.5mm，刮平后，孔中可容糞量41.1mg）放在載玻片中部，以刮片從尼龍絹片上刮取細糞渣填入定量板的中央孔中，填滿刮平。

2.3.2.2.3 小心提起定量板，糞樣即留在載玻片上。

2.3.2.2.4 取一張經(jīng)甘油孔雀綠溶液浸漬24h的親水性玻璃紙（30×30mm），蓋在糞便上，用橡皮塞或另一塊載玻片覆于玻璃紙上輕壓，使糞便均勻展開至玻璃紙邊緣。

2.3.2.2.5 編號后置于室溫25℃，相對濕度75％下過夜，鏡檢。

2.3.2.2.6 每份糞樣至少需做2張涂片，以鏡檢每片平均檢出的蟲卵數(shù)乘以24即為1g糞便中的蟲卵數(shù)（EPG）。

2.3.2.3 診斷標準

發(fā)現(xiàn)日本血吸蟲卵即為血吸蟲病人。

2.3.3 結(jié)果觀察

2.3.3.1 將透明后的加藤片置于光學顯微鏡的載物臺上，在低倍鏡（10×）下進行鏡檢，鏡檢時仔細檢查每一視野，并特別注意與未受精蛔蟲卵的鑒別。

2.3.3.2 計數(shù)原則：數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右，記錄全片血吸蟲卵的數(shù)量。

2.3.4 注意事項

2.3.4.1 親水性透明玻璃紙使用前需全部浸入透明液中，浸泡24h以上，使玻璃紙顯示綠色或藍色。

2.3.4.2 把刮片上的細糞渣填入定量板時，必須填滿中央孔全孔并抹平；壓制涂片時盡量使糞便均勻展開至玻璃紙邊緣，但應避免糞渣溢出。

2.3.4.3 加藤片透明的速度取決于溫、濕度，一般放置室溫過夜即可，冬季溫度較低時則需置25℃溫箱內(nèi)以加快透明，但切忌放置于太陽光直射下加快透明，避免加藤片脫水過度，而影響鏡下蟲卵的觀察。

2.4 B超檢查

因血吸蟲卵沉積肝臟引起肉芽腫，繼后發(fā)生肝纖維化等一系列病理改變，特別是干線型纖維化，及門脈分支血管壁的增厚，可在超聲診斷儀中顯示有特征性圖像，有助于血吸蟲病的診斷醫(yī)`學教育網(wǎng)整理。

2.4.1 器材準備

B超機、藕合劑、衛(wèi)生紙、報告單。

2.4.2 操作步驟

2.4.2.1 空腹平臥位與平靜呼吸時，以劍下橫縱切面，右肋下斜切面及右肋間切面等為肝臟常規(guī)切面，全面探查肝臟回聲情況，檢查肝實質(zhì)纖維化程度，以腎實質(zhì)回聲為正常標準，判斷肝回聲強弱，可分如下4級：

0級-正常；

I級-病灶性回聲密集區(qū)，分散在肝實質(zhì)，沒有明確的界限，具體化為回聲尚均勻，但增強、增粗（光點顆粒稍粗）；

Ⅱ級-較強的光帶形成魚鱗樣圖形，散在性病灶性回聲密集區(qū)直徑20mm，具體化為回聲欠均勻，光點較粗大，全肝均可見散在的細網(wǎng)狀回聲，肝血管壁回聲稍增強、增厚，肝血管起行大致正常；

Ⅲ級-回聲密集帶形成相互連接的網(wǎng)狀，多見直徑20mm的病灶回聲密集區(qū)，有中心纖維化的塊物（組織），具體化為回聲不均勻，光點增粗回聲較高，全肝均可見粗大網(wǎng)絡(luò)狀回聲，門脈血管壁增厚明顯，肝內(nèi)血管腔變細窄，顯示不清，肝臟體積縮小。

2.4.2.2 平臥位肝臟常規(guī)切面，探測肝臟表面與外形，肝表面可分為光滑、輕度不規(guī)則和嚴重不規(guī)則。肝左葉外形，背面凹為正常，凸為異常，下緣銳利為正常，鈍為異常。

2.4.2.3 以平臥位通過腹主動脈劍下縱切面，探測肝左葉長度與厚度。右肋下斜切面，以清楚顯示肝靜脈右支注入下腔靜脈處，控測右葉最大斜位。

2.4.2.4 平臥位探頭置于右側(cè)面中線縱切面，以通過下腔靜脈為參照點，測肝右葉第一長徑。用探頭垂直置于右側(cè)鎖骨中線縱切面，測肝右葉第二長徑。

2.4.2.5 平臥位探頭置于左側(cè)腋中線縱切面，測脾臟長度。右側(cè)45o側(cè)臥位，左肋間斜切面，清楚顯示脾門及脾靜脈，探測脾靜脈寬度。測脾門至脾前緣的長徑（a），經(jīng)脾門（脾靜脈中心）作a線從垂直線段長徑為b，通常僅測脾臟厚度相當于a.成人脾肝厚度3.00cm±0.52cm，脾靜脈不超過0.8cm.

2.4.2.6 取仰臥位，右肋間斜切面或上腹正中旁線縱切面，以清楚顯示門靜脈主干，在第一肝門處，測定它最大內(nèi)徑。

2.4.2.7 取平臥位，肝臟常規(guī)切面（劍下橫切面及右肋間斜切面為主），清楚顯示左肝葉門靜脈第二級分支，測其最寬三支外徑（D）和內(nèi)徑（d），求出d/d比值。

2.4.3 診斷標準

2.4.3.1 肝臟實質(zhì)回聲若有Ⅱ級或Ⅲ級改變者，可擬診為血吸蟲病肝超聲圖像。

2.4.3.2 門靜脈系統(tǒng)D/d＞2者為異常。

2.4.4 注意事項

2.4.4.1 為了測量結(jié)果的可比性，應確定標準化的測量切面，嚴格按規(guī)定放置探頭，而且要在限定切面中測量。而定性檢查時，例如探查肝實質(zhì)回聲密度，切面盡可能在不同水平進行，避免遺漏局灶性的損傷。

2.4.4.2 我國已有不同年齡、不同身高、不同正常人群的肝右葉長度D/d，厚度、肝右葉第一、第二長徑和最大斜徑、脾臟長度、脾臟指數(shù)、門脈主干內(nèi)徑、門脈2級分支D/d比值等，9個項目的測量數(shù)值（見《血吸蟲病防治手冊》第三版P100）可供參考。

2.4.4.3 應與慢性肝炎，肝炎化肝硬化、肝癌等做出鑒別。

2.4.4.4 超聲診斷血吸蟲病正確性與超聲診斷操作者的經(jīng)驗、業(yè)務(wù)水平有關(guān)，應予以注意。