免疫球蛋白具有抗原性,可用以免疫動物制備相應的抗體,而這種抗體常用于免疫球蛋白的檢測。五類免疫球蛋白皆可用前面介紹的純化方法提取出來。如將這些免疫球蛋白分解成片段,如Fc段、Fab段、輕鏈等作為免疫原制備抗血清,則可制得分辨能力更高的特異性抗體。制備方法如下:
1.溫和條件析離亞單位亞單位之間以非共價鍵、如氫鍵、靜電引力等連接起來,這些鍵結(jié)合力較弱,可經(jīng)2種方法將其斷開制備片段。第一種方法是改變pH,一般將pH調(diào)至3~4(羧基滴定范圍)和9~10(賴氨酸-酪氨酸滴定范圍),當?shù)陀?或高于10時,亞單位會離解。這個方法是利用強變性劑,如8mol/L鹽酸胍等。用此可以將亞單位分開。這個方法也用于載脂蛋白抗原的解離和膠原肽的提取醫(yī)|學教育網(wǎng)搜集整理。
2.二硫鍵的解離二硫鍵是連接Ig肽鏈的共價鍵,解離二硫鍵可將輕鏈與重鏈分開。解離的方法多采用氧化法和還原法。氧化法的優(yōu)點是切開后,肽鏈不能重新形成二硫鍵,便于肽鏈純化;缺點是甲硫氨酸被氧化成亞砜,色氨酸側(cè)鏈被破壞。還原法是將二硫鍵還原成巰基。但這個疏基極不穩(wěn)定,易再重新結(jié)合成二硫鍵,必須及時用碘乙酸或碘代乙酰胺進行羧甲基化。
3.溴化氰裂解法溴化氰與蛋白質(zhì)中的甲硫氨酸側(cè)鏈的硫醚基起反應,生成溴化亞氨內(nèi)酯。此產(chǎn)物與水反應,將肽鏈斷裂。
4.酶裂解法因為酶解有極好的專一性,不同的片段可用不同的酶裂解。如木瓜酶可將IgG裂解成Fc和Fab(×2)3個片段,胃蛋白酶可將IgG解成F(ab')2和幾個小肽段,胰蛋白酶則將其切成不規(guī)則的肽鏈。作為抗原制備常用木瓜酶切斷,取得Fc段,以制備抗鏈血清。作為抗體試劑應用,常用胃蛋白酶切斷取得F(ab')2。