【頒布時(shí)間】1987年

【頒布部門】衛(wèi)生部

【正文】

糞大腸菌群細(xì)菌來(lái)源于人和溫血?jiǎng)游锏募S便。檢出糞大腸菌群表明該化妝品已被糞便污染，有可能存在其他腸道致病菌或寄生蟲等病原體的危險(xiǎn)。因此糞大腸菌被列為重要的衛(wèi)生指標(biāo)菌。

1方法提要

根據(jù)糞大腸菌群所具有的生物特性，如革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌在44℃培養(yǎng)24～48h能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸并產(chǎn)氣，能在選擇性培養(yǎng)基上產(chǎn)生典型菌落，能分解色氨酸產(chǎn)生靛基質(zhì)。

2培養(yǎng)基和試劑

2.1乳糖膽鹽培養(yǎng)基

成分：蛋白胨20g

豬膽鹽5g

乳糖5g

0.4%溴甲酚紫水溶液2.5ml

蒸餾水1000ml

制法：將蛋白胨、膽鹽及乳糖溶于蒸餾水中，調(diào)pH到7.4，加入指示劑，混勻，分裝試管（每支試管中加一個(gè)小倒管）。115℃（10lb）20min滅菌。

2.2雙倍濃度乳糖膽鹽培養(yǎng)基按上述乳糖膽鹽培養(yǎng)基成分，蒸餾水量不變，其他成分量加倍。

2.3伊紅美藍(lán)（EMB）瓊脂

成分：蛋白胨10g

乳糖10g

磷酸氫二鉀2g

瓊脂20g

2%伊紅水溶液20ml

0.5%美藍(lán)水溶液13ml

蒸餾水1000ml

制法：先將瓊脂加到900ml蒸餾水中，加熱溶解，然后加入磷酸氫二鉀蛋白胨，混勻，使之溶解。再以蒸餾水補(bǔ)足至1000ml.校正pH值為7.2～7.4，分裝于燒瓶?jī)?nèi)，121℃（15lb）15min高壓滅菌備用。臨用時(shí)加入乳糖并加熱融化瓊脂。冷至60℃左右以無(wú)菌手續(xù)加入滅菌的伊紅美藍(lán)溶液，搖勻。傾注平皿備用。

2.4蛋白胨水（作靛基質(zhì)試驗(yàn)用）

成分：蛋白胨（或胰蛋白胨）20g

氯化鈉5g

蒸餾水1000ml

制法：將上述成分加熱熔化，調(diào)pH值為7.0～7.2，分裝小試管，高壓滅菌121℃（15lb）15min.

2.5靛基質(zhì)試劑

柯凡克試劑：將5g對(duì)二甲氨基苯甲醛溶解于75ml戊醇中，然后緩慢加入濃鹽酸25m1.

試驗(yàn)方法：接種細(xì)菌于蛋白胨水中，于44℃培養(yǎng)24h.沿管壁加柯凡克試劑0.3～0.5ml，輕搖試管醫(yī)學(xué)教`育網(wǎng)整理。陽(yáng)性者于試劑層顯深玫瑰紅色。

注：蛋白胨應(yīng)含有豐富的色氨酸，每批蛋白胨買來(lái)后，應(yīng)先用已知菌種鑒定后方可使用。

2.6革蘭氏染色法

2.6.1染液制備

2.6.1.1結(jié)晶紫染色液：

結(jié)晶紫1g

95%酒精20ml

1%草酸銨水溶液80ml

將結(jié)晶紫溶于酒精中，然后與草酸銨溶液混合。

2.6.1.2革蘭氏碘液：

碘1g

碘化鉀2g

蒸餾水300ml

將碘與碘化鉀先進(jìn)行混合，加入蒸餾水少許，充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至300m1.

2.6.1.3脫色液：95%乙醇。

2.6.1.4復(fù)染液：

a.沙黃復(fù)染液：

沙黃0.25g

95%酒精10ml

蒸餾水90ml

將沙黃溶解于酒精中，然后用蒸餾水稀釋。

b.稀石碳酸復(fù)紅液：稱取堿性復(fù)紅10g，研細(xì)，加95%乙醇100ml，放置過夜，濾紙過濾。取該液10ml，加5%石碳酸水溶液90ml混合，即為石碳酸復(fù)紅液。再取此液10ml加水90ml，即為稀石碳酸復(fù)紅液。

2.6.2染色法

2.6.2.1將涂片在火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染色液，染1min，水洗。

2.6.2.2滴加革蘭氏碘液，作用1min，水洗。

2.6.2.3滴加95%酒精脫色，約30s，或?qū)⒕凭螡M整個(gè)涂片，立即傾去，再用酒精滴滿整個(gè)涂片，脫色10s，水洗。

2.6.2.4滴加復(fù)染液，復(fù)染1min，水洗，待干，鏡檢。

2.6.3染色結(jié)果

革蘭氏陽(yáng)性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。

注：如用1∶10稀釋石碳酸復(fù)紅染色液作復(fù)染液，復(fù)染時(shí)間僅需10s.

3儀器

3.1恒溫水浴或隔水式恒溫箱：44℃。

3.2溫度計(jì)。

3.3顯微鏡。

3.4載玻片。

3.5接種環(huán)。

3.6電爐。

3.7錐形瓶。

3，8試管。

3.9小倒管。

3.10pH計(jì)或pH試紙。

3.11高壓消毒鍋。

3.12滅菌吸管。

3.13滅菌平皿。

4操作步驟

4.1取10ml1∶10稀釋的樣品，加到10ml雙倍濃度的乳糖膽鹽培養(yǎng)基中，置44℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48h，如不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣，則報(bào)告為糞大腸菌群陰性。

4.2如產(chǎn)酸產(chǎn)氣，劃線接種到伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，置37℃培養(yǎng)18～24h.同時(shí)取該培養(yǎng)液1～2滴接種到蛋白胨水中，置44℃培養(yǎng)24h.

經(jīng)培養(yǎng)后，在上述平板上觀察有無(wú)典型菌落生長(zhǎng)。大腸菌群在伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上的典型菌落呈深紫黑色，圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤(rùn)，常具有金屬光澤。也有的呈紫黑色，不帶或略帶金屬光澤，或粉紫色，中心較深的菌落。亦常為大腸菌群，均應(yīng)注意挑選。

4.3挑取上述可疑菌落，涂片作革蘭氏染色鏡檢。

4.4在蛋白胨水培養(yǎng)液中，加入靛基質(zhì)試劑約0.5ml，觀察靛基質(zhì)反應(yīng)。陽(yáng)性者液面呈玫瑰紅色醫(yī)學(xué)教`育網(wǎng)整理；陰性反應(yīng)液面呈試劑本色。

5檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告

平板上有典型菌落，并經(jīng)證實(shí)為革蘭氏陰性短桿菌，靛基質(zhì)試驗(yàn)陽(yáng)性，則可報(bào)告被檢樣品中檢出糞大腸菌群。

附加說(shuō)明：

本標(biāo)準(zhǔn)由中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院環(huán)境衛(wèi)生監(jiān)測(cè)所歸口。

本標(biāo)準(zhǔn)由“化妝品微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法”起草小組起草。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人周淑玉。

本標(biāo)準(zhǔn)由中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院環(huán)境衛(wèi)生監(jiān)測(cè)所負(fù)責(zé)解釋。