核酸酶是一種可經由催化磷酸雙酯鍵的水解，而將DNA鏈切斷的酵素。其中一種稱為外切酶，可水解位于DNA長鏈末端的核苷酸；另一種則是內切酶，作用于DNA兩個端點之間的位置。在分子生物學領域中使用頻率最高的核酸酶為限制內切酶，可切割特定的DNA序列。例如左圖中的EcoRV可辨識出具有6個堿基的5-GAT|ATC-3序列，并從GAT與ATC之間那條垂直線所在的位置將其切斷。此類酵素在自然界中能消化噬菌體DNA，以保護遭受噬菌體感染的細菌，此作用屬于限制修飾系統(tǒng)的一部分。在技術上，對序列具專一性的核酸酶可應用于分子選殖與DNA指紋分析醫(yī)|學教育網(wǎng)搜集整理。

另一種酵素DNA連接酶，則可利用來自腺苷三磷酸或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的能量，將斷裂的DNA長鏈重新接合。連接酶對于DNA復制過程中產生的延遲股而言尤其重要，這些位于復制叉上的短小片段，可在此酵素作用下黏合成為DNA模板的完整復制品。此外連接酶也參與了DNA修復與遺傳重組作用。