本章重點(diǎn)：

　　核酸分子雜交的定義。印漬技術(shù)的原理。探針技術(shù)。Southern、Northern和Western

　　blotting的原理和應(yīng)用。PCR的工作原理、反應(yīng)體系、基本反應(yīng)步驟。人類基因組計(jì)劃和后基因組研究的主要內(nèi)容。

　　本章難點(diǎn)：

　　三大印漬技術(shù)的原理和操作步驟。PCR技術(shù)反應(yīng)體系的建立和基本反應(yīng)步驟。人類基因組分析機(jī)后基因組研究的主要內(nèi)容。

　　一、分子雜交與印漬技術(shù)

　　要點(diǎn)：

　　1．分子雜交是建立印漬技術(shù)的理論基礎(chǔ)。

　　2．印漬技術(shù)：首先由Southern提出?；驹恚簩⒋嬖谟谀z中的生物大分子轉(zhuǎn)移（印漬）于固定化介質(zhì)上并加以檢測(cè)分析的技術(shù)。轉(zhuǎn)移方式：毛細(xì)法、電轉(zhuǎn)移、真空吸引轉(zhuǎn)移。

　　3．探針技術(shù)：用同位素、生物素或熒光染料標(biāo)記一小段已知序列的多聚核苷酸的末端或全鏈，將其作為探針，與固定在膜上的DNA或RNA雜交，以檢測(cè)膜上是否存在同源核酸分子。

　　4．印漬技術(shù)的類別和應(yīng)用

　　（1）Southern blotting：①基本原理與操作：A限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA；B瓊脂糖凝膠電泳；C變性；D將凝膠中的變性DNA區(qū)帶轉(zhuǎn)移到NC膜上；E封阻劑封閉非特異性位點(diǎn)；F加入探針雜交；G放射自顯影或其它方法檢測(cè)雜交區(qū)帶。②應(yīng)用：主要用于基因組DNA的分析。

　?。?）Northern blotting：基本原理與操作同Southern blotting

　　（3）Western blotting：

　?。?）其它：

　　基本概念：

　　1．核酸分子雜交：在DNA復(fù)性過(guò)程中，把不同的DNA單鏈分子放在同一溶液中，或把DNA與RNA放在一起，只要在DNA或RNA的單鏈分子之間存在著一定程度的堿基配對(duì)關(guān)系，就可以在不同的分子間形成雜化雙鏈，這種現(xiàn)象稱為核酸分子雜交。

　　基本要求：掌握核酸分子雜交的概念，三大印漬技術(shù)的原理、操作步驟與應(yīng)用。了解其它印漬技術(shù)如原位雜交、斑點(diǎn)印漬、DNA芯片的特點(diǎn)與應(yīng)用。

　　二、PCR技術(shù)

　　要點(diǎn)：

　　1．PCR的工作原理：

　?。?）基本原理：中文名稱為聚合酶鏈反應(yīng)，是一種DNA的體外擴(kuò)增技術(shù)。其基本原理是以擬擴(kuò)增的DNA分子為模板，以一對(duì)分別與模板5’末端和3’末端相互補(bǔ)的寡核苷酸片段為引物，在DNA聚合酶作用下，按照半保留復(fù)制的機(jī)制沿著模板鏈合成目的DNA的過(guò)程。

　?。?）反應(yīng)體系的基本成分：模板DNA、特異性引物、耐熱性DNA聚合酶、dNTP、含鎂離子的反應(yīng)緩沖液。

　?。?）基本反應(yīng)步驟：①變性：反應(yīng)系統(tǒng)加熱至95℃，使模板DNA雙鏈解離。②退火：將溫度下降至適宜位置，是引物與模板DNA退火結(jié)合；③延伸：溫度上升至72℃，DNA聚合酶以dNTP為底物催化DNA的合成反應(yīng)。

　　2．PCR的主要用途：①目的基因的克??；②基因的體外突變；③DNA的微量分析。

　　基本要求：掌握PCR的基本原理、反應(yīng)體系的組成及基本反應(yīng)步驟。

　　三、核酸序列分析

　　兩大方法：化學(xué)裂解法和DNA鏈末端合成終止法（Sanger法）。目前應(yīng)用最廣泛的是DNA鏈末端合成終止法，DNA自動(dòng)測(cè)序亦是采用此法的主要原理。

　　基本要求：了解目前最常用的核酸序列分析方法是什么。

　　四、人類基因組計(jì)劃與后基因組研究

　　1．人類基因組計(jì)劃的主要內(nèi)容：①遺傳圖分析；②物理圖分析；③轉(zhuǎn)錄圖分析；④基因組序列測(cè)定；⑤資料的儲(chǔ)存與利用。

　　2．后基因組研究：①功能基因組學(xué)；②蛋白質(zhì)組學(xué)。等。

　　基本要求：了解人類基因組計(jì)劃與后基因組研究的主要內(nèi)容。