一、前言

　　以病毒為載體的預(yù)防用活疫苗是指將外源目的基因片段構(gòu)建在病毒載體中，重組后的病毒載體導入機體后可表達目的蛋白，目的蛋白通過刺激機體產(chǎn)生特異性免疫學反應(yīng)而達到預(yù)防某種疾病的目的。該指導原則適用于以病毒為載體的預(yù)防用活疫苗制品。其目的是為該類制劑提供一個共同的原則，具體的方案應(yīng)根據(jù)這些原則，確定具體的申報內(nèi)容。其基本原則是：安全有效，質(zhì)量可控，同時應(yīng)鼓勵創(chuàng)新，促進以病毒為載體疫苗的研究醫(yī)學教|育網(wǎng)搜集整理。對一些新的技術(shù)路線要建立相應(yīng)的質(zhì)控要求，可有一定的靈活性，應(yīng)注意到以病毒為載體活疫苗只是處于研究的初級階段，而且與常規(guī)生物制品相比有其本身的特點，需要不斷的積累經(jīng)驗。為此，申請者應(yīng)加強咨詢和論證，提出一個確保安全有效而又適合實際的申報資料。同時，對每個方案中各個階段的操作過程、中間及最終產(chǎn)品的制備，務(wù)必制訂標準操作規(guī)程及質(zhì)控標準，并予嚴格實施。

　　二、疫苗構(gòu)建的基本要求

　?。ㄒ唬﹪鴥?nèi)外研究現(xiàn)狀、立題依據(jù)和目的及預(yù)期效果

　　1.應(yīng)了解所預(yù)防或治療疾病的流行情況、疾病的危害程度等；包括國內(nèi)及國外對該類疾病的預(yù)防和治療手段。

　　2.應(yīng)了解國內(nèi)外同類產(chǎn)品研究和開發(fā)等情況，其中包括所用的DNA載體、目的基因片段、生產(chǎn)工藝、臨床前試驗和臨床試驗的結(jié)果及進展，以及該類產(chǎn)品所面臨的主要問題。

　　3.對研制該類DNA制品用于預(yù)防疾病的有效性、安全性及必要性進行分析。

　　4.應(yīng)對該方案與國外內(nèi)已批準的或正在進行的方案的不同之處、特點及其優(yōu)越性等進行分析。凡屬新的方案，應(yīng)提供其優(yōu)越性及安全性的依據(jù)。

　　5.利益風險比。根據(jù)該預(yù)防方案可能達到的效果及可能出現(xiàn)的副作用或危害，對總體的利弊權(quán)衡的進行評價，并提出擬采取避免或減少其危害性或副作用的措施。這種評價將是該方案能否獲得批準的重要依據(jù)之一。

　?。ǘ┎《据d體及宿主細胞的有關(guān)內(nèi)容

　　1.目前所用的病毒載體主要包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體以及痘苗病毒載體等。為此，應(yīng)明確病毒載體的來源、結(jié)構(gòu)，并進行必要的專利查詢，其中包括載體DNA的限制性內(nèi)切酶圖譜。若有特殊的元件，如啟動子、增強子以及PolyA位點等，應(yīng)提供詳細資料。若改變結(jié)構(gòu)（如丟失片段或插入片段），須對相應(yīng)片段進行測序分析。若屬新的或改變結(jié)構(gòu)的病毒載體，須對組建的材料、方法、組建步驟及鑒定進行詳細的研究。

　　2.生產(chǎn)用細胞：來源、傳代歷史以及質(zhì)控的材料。包括細胞形態(tài)學、染色體組型、支原體、細菌、病毒等外源因子的檢測結(jié)果。若需用其它輔助病毒，須明確來源、分離的方法步驟等。

　?。ㄈ┠康幕?/p>

　　1.明確目的基因來源的病原體及其它相關(guān)生物分子的基因序列及結(jié)構(gòu)，并與我國主要流行株的核苷酸和氨基酸同源性進行分析以及明確其血清型、基因型和亞型，對該種基因型或血清型的流行情況進行分析，若存在不同的血清型或基因型，應(yīng)對所選擇的血清型或基因型與其它血清型或基因型交叉反應(yīng)或交叉保護性進行分析和研究。

　　2.對目的基因的序列、大小、來源以及表達產(chǎn)物的預(yù)計大小進行分析；醫(yī)學教|育網(wǎng)搜集整理明確目的基因選擇的依據(jù)以及其表達蛋白在防中的作用。

　　3.若對目的基因進行了修飾，應(yīng)對其修飾后的基因序列以及修飾后基因與人類已知基因序列的同源性進行分析。若在表達的目的重組蛋白以外有其它氨基酸寡肽同時表達時，應(yīng)對寡肽的作用和選擇的依據(jù)進行分析。并對基因修飾或重組的利弊權(quán)衡進行分析。

　?。ㄋ模┲亟M病毒的構(gòu)建及種子細胞庫的建立

　　1.應(yīng)對穿梭質(zhì)粒與目的基因連接的詳細步驟進行研究，并對構(gòu)建以后的重組穿梭質(zhì)粒進行檢定和確證。對重組穿梭質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、擴增和純化條件進行研究。

　　2.對目的基因片段導入病毒的過程進行研究，建立切實可行的篩選和確證的方法。對含有目的基因片段的重組病毒的特征進行分析。

　　3.對重組病毒的特性進行檢定，必要時進行序列分析，研究必要的控制元件和選擇標記基因有無變異以及對插入的目的基因序列進行分析，檢查有無變異。

　　4.應(yīng)當對重組病毒感染細胞條件進行優(yōu)化。對重組病毒的的濃度、含量等進行分析。對重組的保存條件以及穩(wěn)定性進行研究。應(yīng)當建立重組病毒庫。應(yīng)對重組病毒庫的外源因子進行分析。

　　5.產(chǎn)病毒的種子細胞庫的組建：由病毒載體轉(zhuǎn)染包裝細胞或非包裝細胞所組建的能復制并產(chǎn)生病毒的細胞系稱為產(chǎn)病毒細胞系，即原始種子細胞庫。該原始種子細胞庫的組建過程必須予以詳細說明，包括材料、方法、步驟、細胞系的鑒定。其中應(yīng)當包括細胞形態(tài)學、染色體組型、傳代次數(shù)、穩(wěn)定性、病毒滴度的檢測、病毒介導目的基因的表達活性以及外源因子的檢查等。

　　6.復制型病毒的檢測：包括方法、技術(shù)可靠性及結(jié)果

　?。ㄎ澹Ρ磉_產(chǎn)物的分析

　　1.將重組病毒感染合適的哺乳動物細胞，對感染條件進行優(yōu)化。

　　2.建立對表達產(chǎn)物的分析方法，包括表達產(chǎn)物的大小、特征等。

　　3.建立對表達產(chǎn)物的免疫學反應(yīng)的特征進行分析的方法。

　　三、生產(chǎn)工藝

　?。ㄒ唬┕ぷ骷毎麕斓慕⒓百|(zhì)控：須明確工作細胞擴增的方法、傳代次數(shù)、倍增時間、可允許的傳代次數(shù)（保持同樣的病毒滴度及轉(zhuǎn)導基因的活性）及工作細胞庫的規(guī)模、保存條件。并對以下內(nèi)容進行研究：

　　1.細胞的均一性：包括細胞形態(tài)學、染色體組型、表型、導入基因的存在狀態(tài)及其表達。

　　2.病毒滴度

　　3.轉(zhuǎn)導基因的活性

　　4.外源因子的檢測結(jié)果

　　5.復制病毒的檢測

　　所有以上的項目在自檢的基礎(chǔ)上，均須由中國藥品生物制品檢定所檢定或由國家藥品監(jiān)督管理局指定的單位檢定。

　?。ǘ┓N子細胞培養(yǎng)方法和擴增的步驟進行優(yōu)化，建立培養(yǎng)過程中的質(zhì)控指標。

　?。ㄈχ亟M病毒的分離、富集及純化的工藝進行優(yōu)化，并建立相應(yīng)的質(zhì)控指標。

　?。ㄋ模υ旱南♂尫盅b的工藝進行優(yōu)化，并建立質(zhì)控指標醫(yī)學教|育網(wǎng)搜集整理。

　?。ㄎ澹┨砑游锏馁|(zhì)控：在細胞培養(yǎng)、制備過程中使用血清、生長因子、抗菌素等時，應(yīng)對去除該類添加物的過程及效果進行研究。并應(yīng)對保存液成份應(yīng)進行安全性研究。

　　四、制品的藥理、毒理學研究

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　　1.復制型病毒的檢測，應(yīng)嚴格檢查復制型病毒并制定相應(yīng)的標準。

　　2.特種添加物：除細胞培養(yǎng)及保存所用的試劑外，如使用明膠、縫線或金屬粒子等其它添加物，應(yīng)對此類物質(zhì)進行動物安全性研究。

　　3.分子遺傳學的評估：應(yīng)對目的基因在體內(nèi)的存在狀態(tài)以及分布情況進行研究。

　　4.目前用于載體的病毒有疫苗株和非疫苗株，對非疫苗株應(yīng)進行嚴格的安全性研究。

　?。ǘ┒纠矸磻?yīng)的評估

　　這也是安全性試驗的重要組成部分。除目的基因可能導致的毒性外，導入系統(tǒng)的安全性評價至為重要，其安全性評估應(yīng)包括急性毒性（最大耐受量）及長期毒性試驗。毒性試驗所用的劑量，除包括相當于臨床使用劑量（按體重或表面積計算）外，尚需有一個較大的劑量。給藥途徑應(yīng)盡可能模擬臨床給藥或?qū)氲男问?。若改變途徑須說明其原因及依據(jù)。毒性反應(yīng)的觀察，除常規(guī)檢測項目外，應(yīng)包括其它相關(guān)的檢測指標。還應(yīng)對局部刺激進行研究。

　?。ㄈ┟庖邔W的評估

　　應(yīng)注意進入體內(nèi)后的免疫反應(yīng)有關(guān)的問題，包括過敏反應(yīng)、排斥反應(yīng)以及機體的自身免疫反應(yīng)等。應(yīng)對這些問題進行研究并提出相應(yīng)的監(jiān)控及處理措施。

　　五、質(zhì)量控制及檢定的要求

　?。ㄒ唬┥a(chǎn)過程中質(zhì)量監(jiān)控標準的建立及要求

　　在生產(chǎn)工藝的各個環(huán)節(jié)和步驟中對其產(chǎn)品均應(yīng)建立相應(yīng)的監(jiān)控標準，以便后續(xù)工藝的進行。由于各申報者所選擇的工藝不同，所制定的監(jiān)控標準和在何步驟進行監(jiān)控可能不同，但其原則是保證產(chǎn)品的質(zhì)量、工藝的連續(xù)性和穩(wěn)定性。

　?。ǘ┊a(chǎn)品的質(zhì)量檢定與要求

　　1.外觀檢查：根據(jù)樣品的特征建立外觀檢查的質(zhì)量標準。

　　2.pH值檢測，可根據(jù)一般生物制品的要求建立標準，一般為7.2±0.5.

　　3.鑒別實驗，主要包括對病毒載體的鑒別和對表達產(chǎn)物的鑒別試驗，對病毒載體的鑒別主要通過免疫學方法檢測病毒蛋白、檢測病毒核酸的大小或限制性內(nèi)切酶對重組病毒的核酸進行酶切分析。對表達產(chǎn)物的分析主要用免疫反應(yīng)檢測基因表達產(chǎn)物和用PCR方法檢測插入基因。

　　4.建立適當?shù)姆椒▽Σ《镜牡味燃昂窟M行檢測。

　　5.體外效力實驗：檢測其體外表達量，需建立定量檢測表達抗原的方法以及表達抗原的定量標準，并對該檢測方法的敏感性以及定量的準確性進行驗證；還應(yīng)檢測表達抗原的圖譜，其各表達目的抗原的大小應(yīng)與預(yù)計大小相同，應(yīng)建立相應(yīng)的方法并進行驗證。制定各表達抗原的量和圖譜的質(zhì)量控制標準。

　　6.建立適當?shù)姆椒z測復制型病毒，并制定相應(yīng)的質(zhì)控標準。

　　7.無菌實驗：應(yīng)檢測需氧菌、厭氧菌以及支原體等，制品中應(yīng)無該類微生物的污染。

　　8.熱原試驗：主要檢測制品中有無熱原物質(zhì)，可用鱟試劑檢測細菌的內(nèi)毒素，并制定相應(yīng)的質(zhì)控標準。

　　9.異常毒性實驗：主要用小鼠和豚鼠進行試驗，一般小鼠腹腔接種一個人用劑量，豚鼠接種5個人用劑量。該試驗是控制該類制品質(zhì)量的重要指標，由于該制品與一般生物制品相比又有其特殊性，應(yīng)根據(jù)病毒的特征建立不同的病毒特異性毒性反應(yīng)，如可將以痘苗病毒為載體的制劑接種在兔背皮下觀察肪性反應(yīng)。

　　10.屬逆轉(zhuǎn)錄病毒的導入系統(tǒng)，應(yīng)特別注意復制型病毒的檢測。檢測范圍，包括前述種子細胞庫、工作細胞庫及最后病毒制品。細胞上清液的取樣應(yīng)相當于培養(yǎng)上清液的5%.細胞須用共培養(yǎng)法，產(chǎn)病毒細胞取樣量須達到每批中1%.檢測方法，須用S+/L-法、標記挽救法或RT/PCR中的兩種方法。必須用陽性對照（COS4070A上清液）及陰性對照作嚴格定量標化，證明其敏感性及可靠性。PCR應(yīng)利用放射同位素雜交或同樣敏感的系統(tǒng)。

　　11.若最終制品為腺病毒，須補充以下資料：

　?。?）腺病毒顆粒數(shù)及感染單位的測定：目前公認的腺病毒的定量，是腺病毒顆粒測定，以腺病毒基因組DNA定量為依據(jù)，以1個OD260單位作為1.11012顆粒；同時要測定感染滴度。

　?。?）復制型腺病毒的檢測：參考美國FDA1996的建議，在一個病人用的腺病毒的總量中，復制病毒不超過1個PFU.在整個制備過程中，從種子細胞庫、工作細胞庫的建立以及以后制備用于臨床的病毒制劑，均需檢測復制型腺病毒。檢測必須有陽性對照，感染分子比率（MOI）在10～100之間（過高MOI可抑制復制型病毒的生長）。

　　12.對殘余宿主細胞的蛋白進行檢測并建立質(zhì)控標準醫(yī)學教|育網(wǎng)搜集整理。

　　13.生物效價：應(yīng)評價其體液免疫和細胞免疫的生物效價。在評價體液免疫效價時，應(yīng)選擇實驗動物的品系，建立檢測動物血清抗體的方法，并對該方法進行驗證，可以計算小鼠ED50以及抗體產(chǎn)生的滴度，如有必要和可行，還應(yīng)當建立評價抗體質(zhì)量的方法，對抗體的質(zhì)進行評價；在評價細胞免疫效價時，應(yīng)當建立檢測評價細胞免疫的方法（如特異性CTL反應(yīng)的方法或Elispot方法等），也可通過對細胞因子的定量檢測評價其細胞免疫情況，如屬于常規(guī)檢定項目，該類方法應(yīng)穩(wěn)定、重復性好、可操作性強，并制定相應(yīng)的質(zhì)量標準。

　　若已有蛋白類疫苗，其評價方法應(yīng)參照有關(guān)蛋白類疫苗的評價方法。

　　若有動物模型，可進行動物保護性實驗。

　　14.佐劑或呈遞物質(zhì)的質(zhì)量評價：如在最終重組DNA制品含有佐劑或呈遞物質(zhì)，則應(yīng)建立檢測該類物質(zhì)的量以及與重組DNA結(jié)合率的方法，并制定質(zhì)量標準。

　　15.添加物的質(zhì)控：添加物指細胞培養(yǎng)、制備過程中所用的血清、生長因子等。應(yīng)建立檢測添加物的方法和質(zhì)控標準。

　　六、臨床研究用樣品要求

　?。ㄒ唬ι暾圛期臨床試驗的申報者，應(yīng)在GMP條件下至少生產(chǎn)一批產(chǎn)品，其每批產(chǎn)量一般不少于1000人份。

　?。ǘ┊a(chǎn)品必須由中國藥品生物制品檢定所進行質(zhì)量復核醫(yī)學教|育網(wǎng)搜集整理。

　?。ㄈ┩瓿擅科谂R床研究后需及時總結(jié)材料并報國家藥品監(jiān)督管理局申請后續(xù)的臨床試驗。若效果明確，可以進行III期臨床試驗。申報者應(yīng)當在GMP和正常規(guī)?；a(chǎn)的條件下，并由中國藥品生物制品檢定所或國家藥品管理局確定的藥品檢驗機構(gòu)進行質(zhì)量復核。