1．通過觀察、檢測龍膽瀉肝丸中馬兜鈴酸含量,與對大鼠急性腎功能損傷和形態(tài)學的影響，探討龍膽瀉肝丸降低腎毒性的作用。方法用含相當生藥關木通3 g、6 g、12 g/（kg*d）的龍膽瀉肝丸水煎液給大鼠連續(xù)灌胃7天,檢測各組大鼠體質量、腎功能及腎組織形態(tài)學變化；并用RP-HPLC測定龍膽瀉肝丸、關木通水煎液馬兜鈴酸含量.結果

① 龍膽瀉肝丸水煎液組馬兜鈴酸含量明顯低于關木通水煎液組（P<0.01）.

② 龍膽瀉肝丸有減低關木通腎毒性作用。結論龍膽瀉肝丸有降低關木通腎毒性作用，與馬兜鈴酸含量降低有關.

2．目前市售龍膽瀉肝丸和含馬兜鈴酸藥物如關木通等中藥的安全性問題十分引人關注。本研究比較和評價了連續(xù)給予按近期中國藥典生產(chǎn)的龍膽瀉肝丸,關木通，三葉木通及五葉木通對小鼠所產(chǎn)生的毒性反應及程度,以提供木通類藥物和龍膽瀉肝丸的安全性資料，確定毒性劑量范圍,為臨床用藥提供參考。方法龍膽瀉肝丸、關木通、三葉木通及五葉木通對小鼠連續(xù)灌胃28d,觀察小鼠的一般情況、進行血液生化學、病理組織學檢查等。剩余1/2小鼠進行停藥25d恢復期觀察。結果龍膽瀉肝丸組在整個試驗期間未見明顯的毒性反應，無毒性反應劑量為〉3.00g/（kg.d）。關木通的無毒性反應劑量為0.06g/（kg.d）；在〉=0.24g/（kg.d）時見體重增長緩慢,耗食量減少，肝、腎功能指標異常,高劑量組明顯。病理觀察可見明顯的腎臟毒性，如腎近曲小管明顯擴張,小管上皮細胞變性、壞死，腎間質炎癥及明顯的纖維化。腎臟病變停藥后仍不能完全恢復。三葉木通和五葉木通組在整個試驗期間未見與藥物相關的毒性反應,無毒性反應劑量分別為0.40和〉10.00g/（kg.d）。結論在本試驗條件下，關木通顯示出明顯的腎臟毒性,其出現(xiàn)毒性的劑量為0.24g/（kg.d），等于臨床用量;而龍膽瀉肝丸、三葉木通和五葉木通未見與藥物相關的毒性反應,其無毒性反應劑量為臨床用量的5-25倍。

3．本研究將根據(jù)中醫(yī)臨床肝膽濕熱的主要客觀表現(xiàn)，參考現(xiàn)代醫(yī)學的膽汁淤積的形成機理，建立模擬肝膽濕熱的動物模型，并對該模型的發(fā)病機理進行探討。在該模型的基礎上研究龍膽瀉肝丸的治療肝膽濕熱的作用及其機理。目的：首先采用ANIT建立模擬中醫(yī)臨床的肝膽濕熱模型，探討該模型在膽汁轉運代謝方面的分子機制。以該模型為基礎，觀察龍膽瀉肝丸治療肝膽濕熱的作用機理，探討作用靶點，從而為龍膽瀉肝丸治療肝膽濕熱提供科學依據(jù)。

方法：

實驗一、大鼠肝膽濕熱模型的建立 將10只大鼠分為對照組和模型組，每組5只。模型組按100mg/kg的劑量一次性灌胃給予α-萘異硫氰酸酯（ANIT）花生油，對照組灌胃同體積花生油。造模后72h，大鼠一一行膽管插管術。收集4 h內的膽汁，按照收集的時間段計算膽汁分泌量。造模后76h檢測血清總膽紅素（TBIL）、直接膽紅素（DBIL）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、總膽固醇（CHO）水平以及肝組織病理變化。此外，將另外5只大鼠分別于灌胃ANIT后12h、24h、48h、72h、96h分別處死一只。另取1只作為正常對照。分別于不同時間點，取出肝臟，提取肝組織總RNA，用RT-PCR方法檢測MDR1b及MRP2 mRNA的表達。

實驗二、觀察龍膽瀉肝丸（LD）對肝膽濕熱模型大鼠和小鼠的清利肝膽作用 將72只大鼠分為6組，分別為對照組，模型組，膽樂膠囊（DL）組和LD 10、5.0、2.5g生藥/kg劑量組。LD各劑量組和DL組每日給藥1次，連續(xù)給藥8天。對照組灌胃同體積花生油。于給藥期間的第5天，除了對照組外，其余各組在給藥后間隔1 h再灌胃給予ANIT 100 mg/kg（僅一次）。于第8天末次給藥后30 min（末次給藥前禁食24 h，不禁水），行膽管插管，收集4 h內的膽汁，按照收集的時間段計算膽汁分泌量。并檢測血清AST、ALT、ALP、TBIL、DBIL、CHO、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）水平以及肝組織病理變化。另外72只小鼠按同樣方法復制模型，最后檢測血清TBIL、DBIL水平。

實驗三、觀察龍膽瀉肝丸對肝膽濕熱大鼠MDR1a、MDR1b、MDR2、MRP1、MRP2表達的影響 將20只大鼠分為4組，分別為對照組、模型組、LD 5.0、2.5 g生藥/kg劑量組。給藥組均于動物處死前8天開始給藥，每日灌胃給藥1次，連續(xù)8天。對照組和模型組灌胃同體積的蒸餾水。其中第5天給藥1h后，除對照組給予花生油灌胃外，其他各組大鼠按100mg/kg一次性灌胃ANIT花生油。第8天取出肝臟。提取總RNA，RT-PCR檢測MDR1a、MDR1b、MDR2、MRP1、MRP2 mRNA的表達。

實驗四、觀察龍膽瀉肝丸對肝膽濕熱大鼠中性粒細胞CD18表達的影響 將20只大鼠分為4組，分別為對照組、模型組、LD 5.0、2.5 g生藥/kg。給藥組均于動物處死前8天開始給藥，每日灌胃給藥1次，連續(xù)8天。對照組和模型組灌胃同體積的蒸餾水。其中第5天給藥1h后，除對照組花生油灌胃外，其他各組大鼠按100mg/kg一次性灌胃ANIT花生油。第8天眼眶靜脈取100μl抗凝血，加入PE標記的CD18抗體，流式細胞儀測中性粒細胞CD18表達，另取血20μl血細胞計數(shù)儀測白細胞及粒細胞總數(shù)。

結果：

實驗一：大鼠肝膽濕熱模型的建立結果顯示，模型組給予ANIT 72h后，大鼠膽汁分泌量在膽管插管后4h內一直顯著低于對照組（P0.05或P0.01），而血清TBIL、DBIL、CHO、ALT、AST、ALP水平明顯高于對照組。組織形態(tài)學觀察可見模型組出現(xiàn)肝細胞壞死和膽管損傷。對照組大鼠MDR1b mRNA無明顯表達，MRP2 mRNA只有較弱表達。模型組大鼠在造模后48h～96h，MDR1b mRNA表達明顯增強，但在造模后24h內表達不明顯。造模后12h、24h，MRP2 mRNA表達較弱，而在造模后48h～96h均表達明顯。

實驗二：龍膽瀉肝丸（LD）對肝膽濕熱模型大鼠和小鼠的清利肝膽作用

1．膽汁分泌結果顯示，模型組的膽汁分泌量較對照組顯著降低（P0.05）。LD各給藥組膽汁分泌量不同程度地高于模型組。LD 5.0g生藥/kg組、LD2.5g生藥/kg組在1h和1.5h時間點的膽汁排泌量較模型組顯著增高（P0.05），其它時間點也有增高趨勢，但無統(tǒng)計學意義。

2．血清TBIL、DBIL、CHO水平 模型組大鼠血清TBIL、DBIL、CHO水平均上升，與對照組比較有明顯差異（P0.01）。而LD 5.0g生藥/kg組、LD2.5g生藥/kg組血清TBIL、DBIL、CHO與模型組比較有降低趨勢，但無統(tǒng)計學意義。

3．血清ALT、AST、ALP 模型組大鼠血清ALT、AST、ALP升高，與對照組比較有明顯差異（P0.01）。LD各劑量組的血清ALT、AST、ALP水平均與模型組比較無差異。

4．血清MDA、SOD、GSH水平 模型組大鼠血清MDA水平升高（與對照組比較P0.01），血清SOD及GSH水平與對照組比較無明顯變化。LD各劑量組血清SOD、GSH水平與模型組比較無明顯差異。LD對血清MDA有降低趨勢（與對照組比較P0.05）。

5．肝臟組織形態(tài)學 各給藥組肝細胞壞死不同程度的輕于模型組，其中LD 2.5g生藥/kg組分別與模型組相比差異顯著（P0.01）。

實驗三：龍膽瀉肝丸對肝膽濕熱大鼠MDR1a、MDR1b、MDR2、MRP1、MRP2表達的影響

1．肝組織MDR1a、MDR1b、MDR 2 mRNA表達模型組大鼠一次性灌胃ANIT 72h后，肝組織MDR1a、MDR1b mRNA表達顯著增加（P0.05，P0.01）。MDR2 mRNA也增加，但未達統(tǒng)計學意義。LD 5.0g生藥/kg和LD 2.5g生藥/kg對肝膽濕熱模型大鼠的肝組織MDR1a、MDR1b、MDR2 mRNA表達無明顯影響。

2．肝組織MRP1 mRNA和MRP2 mRNA表達模型組大鼠一次性灌胃ANIT 72h后，MRP2 mRNA表達下降，但與對照組相比無統(tǒng)計學意義。MRP1 mRNA的表達未見明顯變化（P0.05）。LD 5.0g生藥/kg和LD 2.5g生藥/kg對肝膽濕熱模型大鼠的肝組織MRP1、MRP2 mRNA表達無明顯影響。

實驗四：龍膽瀉肝丸對肝膽濕熱大鼠中性粒細胞CD18表達的影響 結果顯示，LD各給藥組白細胞總數(shù)以及粒細胞總數(shù)有下降趨勢，CD18熒光強度明顯低于模型組。

結論：通過以上實驗，我們認為，通過灌胃ANIT，所建立的模型具有肝內、體內膽汁淤積，肝酶水平增高，肝細胞損傷等病理生理特征，與中醫(yī)臨床上以身目黃疸為主要表現(xiàn)的肝膽濕熱證類似，可以作為肝膽濕熱模型。該模型的肝臟組織中MDR及MRP mRNA表達發(fā)生變化，而MDR及MRP是與膽汁轉運代謝有關的分子。說明MDR及MRP參與該肝膽濕熱模型的形成。龍膽瀉肝丸能增加膽汁流量，加速膽汁排出，但是對膽汁轉運代謝分子MDR1a、MDR1b、MDR2、MRP1、MRP2等均無顯著影響。結果提示，龍膽瀉肝丸治療肝膽濕熱的作用機制可能與增加毛細膽管膽汁流量、減輕脂質過氧化反應、穩(wěn)定細胞膜、阻抑CD11/CD18介導的中性粒細胞-內皮細胞粘附有關。