根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際情況,我們將其稍作修改,做成了GLP文件,但其中仍有許多可改進(jìn)或需要注意的地方,其中有一些對(duì)普通感受態(tài)效率的提高也有一定的幫助。
1、所用器具的潔凈程度。這一點(diǎn)非常重要,是所有與感受態(tài)有關(guān)的方法與文章上必講的,毋庸置疑。
2、培養(yǎng)基的裝量:培養(yǎng)基的裝量是很重要的,這關(guān)系到菌體生長(zhǎng)過(guò)程中的能量代謝問(wèn)題,是有氧還是無(wú)氧生長(zhǎng)。厭氧生長(zhǎng)出來(lái)的菌體是做不出效率高的感受態(tài)的。建議裝量不要高于此值為:培養(yǎng)基體積/三角瓶容量=100ml/500ml,50ml/250ml.
3、培養(yǎng)基的pH值。這是講的pH值并非單指配置或滅菌后的pH值,而且還包括整個(gè)搖瓶結(jié)束后的pH值。一般來(lái)說(shuō),接種前的pH值在6.8-7.2,等菌搖好后,可以測(cè)一下pH值,不要低于6.0,最好在6.5以上。這表示菌體的代謝為有氧代謝,生長(zhǎng)狀態(tài)良好,按要求做,肯定效率不低。
4、培養(yǎng)后的OD值。其實(shí)這并非一個(gè)非常重要的參數(shù),只是當(dāng)OD值大到一定的程度后,菌體要保持對(duì)數(shù)生長(zhǎng)已經(jīng)不太可能,因此很多指導(dǎo)方法上強(qiáng)調(diào)OD不得大于0.6,0.8等等。同時(shí),OD值大時(shí)菌體總量大,因而感受態(tài)絕對(duì)數(shù)量要大一點(diǎn),因而需要在OD值的兩方面影響中找一個(gè)平衡點(diǎn)。
5、培養(yǎng)基中的各種離子。經(jīng)驗(yàn)證明,當(dāng)培養(yǎng)基中存在一定量的Mg2+離子時(shí),該方法制得的感受態(tài)要相對(duì)較高。在制備普通感受時(shí),使用20mMMgCl2做為培養(yǎng)基的添加物,在感受態(tài)收獲之前20-30分鐘加入,會(huì)收到很好的效果。
6、培養(yǎng)溫度。文獻(xiàn)及經(jīng)驗(yàn)告訴我們,較低的溫度培養(yǎng)有利于感受態(tài)的形成,這樣可以獲得較高的感受態(tài),但太低又不實(shí)用,因而產(chǎn)生了Inoue的高效感受態(tài)制備方法,它實(shí)際是利用了所有有利于感受態(tài)的文獻(xiàn)而得出的一個(gè)非常理想方法。
7、此外文獻(xiàn)報(bào)道,在保存感受態(tài)時(shí),DMSO要比甘油的效果要好,它會(huì)使感受態(tài)的效率增加。醫(yī)學(xué)教育網(wǎng)搜|索整理
8、液氮速凍也會(huì)使感受態(tài)的效率提高,因此推薦用液氮速凍感受態(tài),然后保存于超低溫冰箱內(nèi)。至于在液氮中保存12小時(shí)以后再轉(zhuǎn)入超低溫冰箱,這點(diǎn)未做實(shí)驗(yàn),只是一種感覺(jué),第一次這樣做了,沒(méi)問(wèn)題,以后就照此辦理而已。