可溶性抗原選擇性沉淀法是檢驗師考試一個考點,醫(yī)學(xué)教育網(wǎng)為了幫助大家復(fù)習(xí)準備好考試,將可溶性抗原選擇性沉淀法相關(guān)內(nèi)容整理如下:
選擇性沉淀是采用各種沉淀劑或改變某些條件促使抗原成分沉淀,從而達到純化的目的。
1.核酸去除法從微生物或細胞提取蛋白質(zhì)抗原時,其中常含有大量核酸成分。除去核酸可用提取沉淀劑,如氯化錳、硫酸魚精蛋白或鏈霉素等。核糖核酸降解法較為簡便,用DNA或RNA酶與提取液共同作用30~60min(4℃),即可有效地除去核酸成分。
2.鹽析沉淀法這是最古老而又經(jīng)典的蛋白質(zhì)純化分離動技術(shù)。醫(yī)學(xué)教育|網(wǎng)搜集整理由于方法簡便、有效、不損害抗原活性等優(yōu)點,至今仍被廣泛應(yīng)用。
(1)抗原的粗篩:用不同飽和度的硫酸銨或硫酸鈉可將一個復(fù)雜的組織液吩成若干組分,也可收集某一飽和度的鹽析沉淀物作為進一步純化的粗篩物。最常用的鹽析劑是33%~50%飽和度的硫酸銨。
(2)提取丙種球蛋白:醫(yī)學(xué)教育|網(wǎng)搜集整理丙種球蛋白主要為IgG(95%以上)。將35%~40%飽和度的硫酸銨沉淀物經(jīng)去鹽后可直接用于某些試驗作為抗體試劑。此法簡單、穩(wěn)定、固收率高,已成為免疫化學(xué)試驗的常規(guī)方法。
(3)抗原的濃縮:在液體中含量較少的抗原,如尿中的游離輕鏈及離子交換層析洗脫液中的抗原,可通過加入硫酸銨,將其沉淀下來,以利進一步純化。
3.有機溶劑沉淀法有機溶劑以降低溶液的介電常數(shù),從而增加蛋白質(zhì)分子上不同電荷的引力,導(dǎo)致溶解度降低。另外,有機溶劑與水作用,能破壞蛋白質(zhì)的水化膜,故蛋白質(zhì)在一定濃度的有機溶劑中被沉淀析出。使用的有機溶劑多為乙醇和丙酮。高濃度的有機溶劑易引起蛋白質(zhì)變性、失活、操作必須在低溫下進行。Cohn(1942)低溫酒精沉淀法可將血漿蛋白分為5個組分,IgG屬于Cohn-3組分。
4.水溶性非離子型聚合物沉淀法常用的聚合物為聚乙二醇(PEG)及硫酸葡聚糖。水溶性聚合物沉淀蛋白質(zhì)的機制尚不清楚,大致有如下解釋:①聚合物與蛋白質(zhì)形成共沉物;①聚合物與蛋白質(zhì)之間發(fā)生水的重分配;①聚合物與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物。此法受許多因素影響,主要是pH、離子強度、蛋白質(zhì)濃度和PEG的分子量等。分子量為2000~6000的PEG皆適宜于做蛋白沉淀用。如若使用得當(dāng),效果甚為滿意。一般認為,PEG濃度在3%~4%時沉淀免疫復(fù)合物,6%~7%可沉淀IgM,8%~12%可沉淀IgG,12%~15%可沉淀其他球蛋白,25%可沉淀白蛋白。最突出的應(yīng)用是用3%~4%的PEG沉淀免疫復(fù)合物,未結(jié)合的抗原和抗體留在溶液中。按此原理設(shè)計了快速測定法和循環(huán)免疫復(fù)合物測定法。
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