先天愚型也稱唐氏綜合征（Down‘s syndrome），是人類最常見(jiàn)的染色體異常疾病，被公認(rèn)為先天性智力低下的最常見(jiàn)的遺傳因素。1959年Lejeune 證實(shí)21三體為天愚型的發(fā)病原因。90年代發(fā)現(xiàn)與先天愚型相關(guān)區(qū)為21q22 ，先天愚型為多基因表達(dá)的結(jié)果，額外的一條21號(hào)染色體導(dǎo)致某些基因增強(qiáng)表達(dá)和某些正?；虍a(chǎn)物過(guò)剩，造成一些重要的生化代謝不平衡。目前，先天愚型患兒出生率為1.3‰，95％的病人為21三體，其余為易位或嵌合型。三體的產(chǎn)生主要是染色體不分離的結(jié)果，多年來(lái)人們注意到染色體不分離與母親的年齡密切相關(guān)，35歲以上的婦女染色體不分離的機(jī)率增大。產(chǎn)前診斷是預(yù)防性優(yōu)生學(xué)的重要措施之一，可以檢出染色體異常的胎兒，使大約半數(shù)的35歲上以婦女免于生產(chǎn)患兒，并使先天愚型患兒的出生率下降約1/4.

    先天愚型的產(chǎn)前診斷技術(shù)大致分為兩類：侵入性和非侵入性技術(shù)。侵入性檢查包括抽羊水細(xì)胞、絨毛組織取材、經(jīng)臍靜脈取胎兒臍帶血等。非侵入性檢查包括孕母血液生物化篩查、宮頸管脫落細(xì)胞檢查，外周血中胎兒細(xì)胞檢查及超聲波檢查。在這些診斷方法中應(yīng)用了傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)方法、生物化學(xué)和物理學(xué)手段以及近幾年發(fā)展起來(lái)的分子生物學(xué)技術(shù)。

    染色體顯帶技術(shù)

    1996年Steel 和Breg應(yīng)用離體培養(yǎng)的羊水細(xì)胞成功地進(jìn)行了胎兒核型分析，1968年Valenti 與Nadler應(yīng)用此技術(shù)報(bào)道了首例先天愚型的產(chǎn)前診斷。至1976年羊膜穿刺技術(shù)已成為產(chǎn)前診斷的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。羊膜穿刺術(shù)通常在孕15～16周進(jìn)行，一般較安全，診斷染色體異常疾病的可靠性約96％，但仍可造成0.5 ％的自發(fā)流產(chǎn)，并可由于操作不當(dāng)誤傷胎兒?；谶@些危險(xiǎn)，再加上羊水細(xì)胞需培養(yǎng)2 ～3周，確診后孕婦只能行引產(chǎn)術(shù)，承受很大痛苦。

    絨毛組織檢查提供了一個(gè)孕早期產(chǎn)前診斷方法。孕8 周左右在超聲監(jiān)測(cè)下從胎肋取滋養(yǎng)細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)和常規(guī)的染色體分析。該法可使診斷提早2 個(gè)月左右，便于及時(shí)終止妊娠，減少活孕婦痛苦。

    國(guó)外有報(bào)道先天愚型并非全部為核型異常，1991< 醫(yī)學(xué)教育網(wǎng)收集整理> 年有報(bào)道分析了257 例先天愚型患者的核型，其中14例（占5.4 ％）患者具有正常核。在243 例核型異?；颊咧?，225 例（92.6％）具有三條21號(hào)染色體，10例（4.1 ％）為嵌合型，8 例（3.3 ％）為易位。還有的學(xué)者則檢出了更高比例（11％）的具正常核型的先天愚型患者。無(wú)論這是否實(shí)驗(yàn)誤差都說(shuō)明僅靠常規(guī)的細(xì)胞遺傳學(xué)方法是不夠的。

    孕母血液生物化學(xué)篩查

    以年齡劃分先天愚型高危孕婦，大約只能檢出30％的胎兒，而由于超過(guò)半數(shù)的婦女不愿做羊膜穿刺，實(shí)際上能檢出的還不到15％。結(jié)合檢查孕母血液生物化學(xué)指標(biāo)卻可使檢出率得到提高。

    一、AFP 、uE3 和hCG

    普遍認(rèn)為甲胎蛋白（AFP ）和非結(jié)合雌三醇（uE3 ）的下降及hCG 的升高是一個(gè)非常有效的篩查給合，對(duì)篩查21三體胎兒較為特異。在小于35歲的孕婦可作為產(chǎn)前篩查先天愚型胎兒的有效手段，檢出率達(dá)57％，對(duì)于35歲以上的婦女可以此作為進(jìn)一步羊膜穿刺細(xì)胞遺傳學(xué)診斷的參考指標(biāo)，減少羊膜穿刺率，降低正常胎兒丟失率。

    1992年Spencer 提出游離型β-hCG在孕早期14～16周時(shí)結(jié)合AFP 和孕母年齡可將檢出率提高到77％，認(rèn)為β-hCG作為總hCG 的亞單位，對(duì)于篩查先天愚型胎兒意義更大?，F(xiàn)采用較多的是游離β-hCG與AFP 聯(lián)合的孕中期二指標(biāo)篩查法。

    另外，二聚抑制素A 是睪丸分泌的一種水溶性激素，其在孕中期水平的提高也可提示妊娠先天愚型胎兒，可與AFP 、游離β-hCG聯(lián)合檢測(cè)提高檢出率。

    二、妊娠蛋白

    近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)婦女在妊娠期間，血漿中出現(xiàn)與妊娠有關(guān)的多種含量較高的蛋白質(zhì)，而在非孕婦女含量甚微。這些蛋白可來(lái)源于胎兒、胎盤(pán)和母體，隨妊娠月份增加而含量逐漸升高，統(tǒng)稱妊娠蛋白。其中特異性β1 糖蛋白（Pregnancy specific- β1-Glycoprotein，SPI ）是胎盤(pán)合體滋養(yǎng)層細(xì)胞產(chǎn)生的一種糖蛋白，妊娠6 ～12周間21三體胎兒母血SPI 值明顯高于正常對(duì)照組。

    另一種與先天愚型有關(guān)的妊娠蛋白，妊娠相關(guān)血漿蛋白A （Pregnancey-associated plasma protein A，PAPP-A），是由胎盤(pán)合體滋養(yǎng)層細(xì)胞和蛻膜分泌的大分子糖蛋白，在早期妊娠時(shí)，21三體胎兒的母血PAPP-A含量顯著低于正常孕婦。

    上述生化篩查對(duì)檢出先天愚型胎兒是十分必要的，但確診仍需羊膜穿刺。

    超聲波檢查

    有學(xué)者建議在用生物化學(xué)手段篩查先天愚型胎兒前最好所有孕婦都是做超聲波檢查，以降低假陽(yáng)性率，增加檢出率。已發(fā)現(xiàn)先天愚型胎兒雙頂經(jīng)與股骨長(zhǎng)度之比、雙頂徑與肱骨之比增大，且有學(xué)者認(rèn)為肱骨長(zhǎng)度與孕齡的關(guān)系是簡(jiǎn)單也是最有效的篩查方法。同樣，在B 超下發(fā)現(xiàn)項(xiàng)褶厚度增加、羊水過(guò)多、十二指腸閉鎖、腎盂擴(kuò)張或心臟異常均提示先天愚型胎兒的可能，且多項(xiàng)指標(biāo)的異常比一項(xiàng)異常提示患兒的風(fēng)險(xiǎn)更大。雖然關(guān)于超聲波檢查的爭(zhēng)論較多，但仍提供了有價(jià)值的參考。

    分子生物學(xué)技術(shù)

    一、熒光原位雜交技術(shù)

    由于構(gòu)成染色體的DNA 鏈基本上是沿著染色體軸成線形排列，因而可以將DNA序列直接與染色體進(jìn)行雜交并在染色體上定位。熒光原位雜交技術(shù)（FISH）因其雜交信號(hào)位置分辨率高，雜交信號(hào)強(qiáng)弱能進(jìn)行定量分析，以及能同時(shí)用不同熒光標(biāo)記的多種探針?lè)治龅葍?yōu)點(diǎn)，在基因定位、染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)導(dǎo)演等研究領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。

    近年的研究發(fā)現(xiàn)，每條染色體在間期核中都占據(jù)一個(gè)獨(dú)立的位點(diǎn)，可在間期核上顯示染色體的位點(diǎn)用于診斷。這就使FISH方法在診斷染色體數(shù)目畸變時(shí)僅用1 ～2 天即可。應(yīng)用FISH做先天愚型產(chǎn)前診斷的關(guān)鍵在于探針的特異性和高效性。

    目前探針主要有3 類：①區(qū)域特異或稱位點(diǎn)特異的DNA 片段，克隆在噬菌體、粘?；蚪湍溉斯と旧w（YAC ）等載體中；②染色體全長(zhǎng)“描繪”探針，來(lái)自染色體特異性基因庫(kù)；③著絲粒重復(fù)探針。這3 類探針各有利弊，一般來(lái)講從21號(hào)染色體特異的粘粒群或YACs構(gòu)建的DNA 探針對(duì)于間期核的檢測(cè)較為有效。

    1.絨毛組織和羊水細(xì)胞的FISH很多學(xué)者對(duì)絨毛細(xì)胞和羊水細(xì)胞的中期染色體和間期細(xì)胞核進(jìn)行了21三體的FISH檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)利用從羊水或絨毛取材的細(xì)胞不必經(jīng)培養(yǎng)，直接做間期核FISH即可診斷大部分先天愚型胎兒。Kuo 等用21號(hào)染色體全長(zhǎng)描繪探針檢測(cè)了5 例三體胎兒的羊水細(xì)胞，結(jié)果三體細(xì)胞中45％～52％顯示了3 個(gè)雜交信號(hào)，40％～44％顯示2 個(gè)雜交信號(hào)。其后隨著探針技術(shù)的發(fā)展，使用粘粒探針使三體細(xì)胞正確顯示雜交信號(hào)的百分率明顯提高了。Bryndorf檢測(cè)兩例未培養(yǎng)三體絨毛細(xì)胞，具3 個(gè)相雜交信號(hào)的細(xì)胞分別為54％和90％；Klinger檢14例三體胎兒未培養(yǎng)羊水細(xì)胞，50％～80％的細(xì)胞顯示3 個(gè)雜交信號(hào)。但此法在診斷染色體結(jié)構(gòu)改變和嵌合體方面尚需總結(jié)更多的資料來(lái)驗(yàn)證。目前仍以≥60％的細(xì)胞顯示2 個(gè)雜交信號(hào)、≤20％的細(xì)胞顯示3 個(gè)雜交信號(hào)診斷為正常核型，以≥60％～70％的細(xì)胞顯示3 個(gè)雜交信號(hào)診斷為三體核型。這是Bryondorf 在檢測(cè)了2626例正常核型標(biāo)本和48例三體核型標(biāo)本的基礎(chǔ)上得出的結(jié)論，且由于其標(biāo)本例數(shù)多，細(xì)胞正確顯示染色體數(shù)目（亦即雜交信號(hào)數(shù)目）的百分率也明顯提高了。

    2.孕婦外周血中胎兒細(xì)胞檢測(cè)大約80％的先天愚型兒是35歲以下年齡婦女妊娠，由于侵入性方法的危險(xiǎn)性，一般35歲以下婦女不做羊水穿刺、絨毛膜取材和取胎兒臍帶血，所以尋找有效的非侵入方法十分重要。隨著從孕婦外周血分離胎兒細(xì)胞方法的建立，無(wú)創(chuàng)性取材與分子生物學(xué)技術(shù)的結(jié)合使先天愚型產(chǎn)前診斷方法有了進(jìn)一步的發(fā)展。

    胎兒有4 類細(xì)胞會(huì)經(jīng)過(guò)胎盤(pán)進(jìn)入母體循環(huán)中。這4 類細(xì)胞為滋養(yǎng)層細(xì)胞、有核紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞。在1ml 母血中大約每100 萬(wàn)個(gè)有核細(xì)胞中存在1個(gè)胎兒細(xì)胞，其波動(dòng)范圍相當(dāng)大。面對(duì)如此稀少的胎兒細(xì)胞，首要的是使用某種有效的方法從母體中分離富集這些細(xì)胞。目前國(guó)外采用較多是下列4 種：①流式細(xì)胞術(shù)分選法；②磁珠分離法；③免疫親合層析法；④密度梯度離心法。

    現(xiàn)普遍認(rèn)為母體中的有核紅細(xì)胞數(shù)量最多，免疫抗體特異性最強(qiáng)，壽命短，前次妊娠影響小，是產(chǎn)前診斷中最有應(yīng)用前途的1 種胎兒細(xì)胞，也是目前應(yīng)用最成功的細(xì)胞。

    elias 小組和Ganshirt小組分別報(bào)道了他們對(duì)從孕母血分離的患兒有核紅細(xì)胞時(shí)行的FISH檢測(cè)，細(xì)胞顯示3 個(gè)雜交信號(hào)的百分率一般較低，分別為2.8 ％～74％和10％～17％。Elias 將三體信號(hào)百分率74％的標(biāo)本的FISH的結(jié)果與其羊水穿刺及流產(chǎn)胎兒組織染色本核型對(duì)比，證實(shí)確為21三體，進(jìn)一步分析證實(shí)該例檢測(cè)時(shí)為流產(chǎn)早期，母血流中存在較多胎兒三體細(xì)胞，因此三體信號(hào)百分率相對(duì)較高。目前分離、富集胎兒細(xì)胞，排除母源細(xì)胞污染仍是一個(gè)未徹底解決的問(wèn)題。

    妊娠誘導(dǎo)紅細(xì)胞增生，使得母源性有核紅細(xì)胞在循環(huán)中出同，干擾了胎兒細(xì)胞檢測(cè)。

    雙色熒光標(biāo)記可輔助區(qū)別母源或胎兒源性有核紅細(xì)胞。Bianchi 用轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（TRF ）在單克隆抗體分選富集胎兒的細(xì)胞（TFR 存在于胎兒有核紅細(xì)胞上，而母源細(xì)胞上無(wú)此受體），并用特異性Y 染色體探針和21染色體探針同時(shí)進(jìn)行熒光原位雜交，在TFR 陰性細(xì)胞中顯示2 個(gè)21號(hào)染色體信號(hào)而無(wú)Y 染色體信號(hào)，說(shuō)明是母體細(xì)胞；在TFR 陽(yáng)性細(xì)胞中觀察到3 個(gè)21號(hào)染色體信號(hào)和1 個(gè)Y 染色體信號(hào)，說(shuō)明該孕婦妊娠胎兒為男性21三體。他的研究成果非常令人鼓舞，但由于其不穩(wěn)定性還需進(jìn)一步探索。

    二、引物介導(dǎo)的原位標(biāo)記

    盡管如此，應(yīng)用FISH作為常規(guī)的產(chǎn)前診斷方法目前尚存在許多困難。由于高效的21號(hào)染色體特異探針尚在研究中，獲得此探針的方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，難以推廣應(yīng)用。Koch等1989年建立了寡核苷酸引導(dǎo)介導(dǎo)的原位DNA 合成（Oligonucleotide-primed in situ DNA synthesis ，PRINS ）技術(shù)。其基本原理是染色體特異的寡核苷酸引物與染色體雜交，在該引物介導(dǎo)下進(jìn)行DNA 合成反應(yīng)，鏈延伸中摻入標(biāo)記的核苷酸，通過(guò)熒光顯色檢測(cè)特異性的染色體信號(hào)。與FISH一樣，既可用于中期染色體，也可用于細(xì)胞間期核，進(jìn)行有關(guān)染色體的研究。該方法簡(jiǎn)便易于掌握，整個(gè)過(guò)程類似原位PCR ，但只需一個(gè)循環(huán)，省時(shí)省力，同時(shí)避免了制備特異探針的繁雜過(guò)程。Pellestor 檢測(cè)了2 例21三體羊水細(xì)胞，分別有75.2％和78.9％的細(xì)胞顯示3 個(gè)熒光信號(hào)。PRINS 技術(shù)的關(guān)鍵是準(zhǔn)確的退火溫度和避免粗暴操作。

    雖然目前有關(guān)此技術(shù)用于染色體病檢測(cè)的報(bào)道尚不多見(jiàn)，但可預(yù)見(jiàn)，它的出現(xiàn)也許會(huì)取代FISH成為一項(xiàng)重要的分子生物學(xué)產(chǎn)前診斷方法。PRINS 具有本底低、分析時(shí)間短、信號(hào)強(qiáng)三大優(yōu)點(diǎn)。理論上像FISH一樣也可同時(shí)標(biāo)記幾種染色體或者進(jìn)行幾次連續(xù)的PRINS ，其發(fā)展會(huì)十分迅速。

    三、PCR

    pCR 簡(jiǎn)單易行，在臨床診斷中應(yīng)用很多。Lee 等用同源性基因定量PCR 的方法，即用一對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增兩個(gè)高度同源的基因：位于21號(hào)染色體上的肝型磷酸果糖激酶基因和位于1 號(hào)染色體上的肌型磷酸果糖激酶基因。以后者為自身對(duì)照，比較100 例正常二倍體和34例先天愚型（包括2 例非平衡易位患者）基因量的差異。結(jié)果顯示正常二倍體肌型磷酸果糖激酶產(chǎn)物/ 肝型磷酸果糖激酶產(chǎn)物為1.33±0.323 ，而先天愚型患者為0.40±0.16，與正常二倍體有顯著差異（P ＜0.001），說(shuō)明定量PCR 技術(shù)的建立可為21三體產(chǎn)前診斷開(kāi)辟新的途徑。先后有一些學(xué)者已利用特異的引物及內(nèi)對(duì)照，對(duì)21三體未培養(yǎng)羊水細(xì)胞、胎血、胎兒組織等進(jìn)行了PCR ，檢測(cè)小片段簡(jiǎn)單串聯(lián)重復(fù)序列（STR ）、超氧化物歧化酶（SOD ）、S-100B等，發(fā)現(xiàn)它們與正常標(biāo)本存在明顯差異。該法適于檢測(cè)細(xì)胞較少的標(biāo)本，如早期羊水穿刺標(biāo)本和從母血分離的胎兒細(xì)胞。該法的優(yōu)點(diǎn)是快速，在24小時(shí)內(nèi)即可得到結(jié)果，但目前定量PCR 方法尚不完善，有待進(jìn)一步探索。

    綜上所述，各種方法各有優(yōu)劣，相互之間仍無(wú)法代替。尋找對(duì)先天愚型胎兒快速、準(zhǔn)確、安全的早期診斷方法仍是一項(xiàng)重要的課題。